В чем измеряется интенсивность флуоресценции

21.2.4. Влияние различных факторов на интенсивность флуоресценции растворов

Люминесценция и, в частности, флуоресценция в гораздо большей степени подвержена влиянию различных факторов, чем поглощение света. Интенсивность флуоресценции зависит от: • природы вещества ; • концентрации вещества в растворе ; • условий, в которых находится флуоресцирующее вещество (температура, растворитель, рН, наличие в растворе других веществ, способных влиять на флуоресценцию). Природа вещества Неорганические соединения (за исключением некоторых соединений урана, лантанидов) обычно не способны флуоресцировать в растворе. В то же время среди органических соединений флуоресцирующих веществ достаточно много. Необходимым (но не достаточным!) условием для фотолюми- несценции является способность вещества поглощать электромагнитное излучение УФили видимого диапазона . Обычно веще- ства, обладающие интенсивной флуоресценцией, имеют длинную систему сопряжённых связей. Наиболее часто флуоресцирующие вещества встречаются среди ароматических соединений. Введение в бен- зольное кольцо электронодонорных заместителей увеличивает способность вещества флуоресцировать . Например, многие фенолы и ароматические амины обладают интенсивной флуоресценцией. Вве- дение электроноакцепторных заместителей , за некоторым исключением, уменьшает флуоресценцию . Атомы тяжёлых галогенов (Br, I) увеличивают скорость интеркомбинационной конверсии и, тем самым, уменьшают квантовый выход флуоресценции . Однако вве- дение тяжёлых галогенов увеличивает способность вещества фосфо- ресцировать. Способность вещества к флуоресценции в растворе

Инструментальные методы анализа увеличивается при конденсации ароматических колец и увеличении «жёсткости» молекулы . Например

O	O	O	O	O
флуоресцирует
флуоресцеин	COO	COO фенолфталеин

Концентрация вещества Зависимость между интенсивностью флуоресценции и концентрацией флуоресцирующего вещества в растворе более сложная, чем между поглощением света и концентрацией. Это связано с тем, что процесс излучения является вторичным и зависит от предшествующего ему процесса поглощения света. Рассмотрим простейший случай, когда в растворе находится только одно флуоресцирующее вещество.

I f = kN f = kQN погл		′	′	− I)	I = I 0 10	−εl C
		N погл = k ∆ I = k (I 0
Таким образом:
I f	′	(1 − 10	−εl C	)
	= kk QI 0

Следовательно, зависимость между интенсивностью флуо- ресценции и концентрацией флуоресцирующего вещества не является линейной. Функцию 10 −εl C можно разложить в ряд Маклорена

10 −εl С = 1 − 2,3 εl C +	(2,3 εl C) 2	−	(2,3 εl C) 3	+ .
	2!		3!

Если произведение εl С (оптическая плотность раствора) невелико, то 10 −εl С ≈ 1 − 2,3 εl C и тогда I f = 2,3kk ′ Q εl C = KC Таким образом, при малых значениях оптической плотности (при λ возб ) зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации можно считать линейной , что и используется в количест- венном анализе. При более высоких значениях A зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации становится более сложной и отклоняется от линейной. При A = 0,01 отклонение от линейности составляет 1%, 0,05 — 5%; 0,5 — около 35% (рис. 21.4).

Раздел 3
область , в которой I	I	I	1
можно считать
прямо пропорциональной А			2
0,0	0,1	0,2
A
Рис. 21.4. Зависимость между интенсивностью флуоресценции и оптиче-
ской плотностью раствора
1) рассчитанная по упрощённой формуле I = KC; 2) реальная

Влияние оптической плотности раствора на интенсивность флуоресценции называется « эффектом внутреннего фильтра ». Этот эффект обусловлен двумя причинами: • поглощением возбуждающего света , вследствие чего частицы, находящиеся дальше от источника излучения, будут получать меньше возбуждающего излучения; • поглощением одними частицами вещества излучения , испускаемого другими частицами этого же вещества. Условия, в которых находится флуоресцирующее вещество Растворитель может оказывать влияние на величину разности между λ max спектра поглощения вещества (или спектра возбуждения флуоресценции) и спектра испускания. При увеличении диэлектрической проницаемости растворителя эта разность, называемая Стоксовым сдвигом , увеличивается. Растворитель влияет также и на величину квантового выхода флуоресценции, увеличивая её или уменьшая. Например, квантовый выход флуоресценции эозина в воде равен 0,2, а в ацетоне — близок к 1. Влияние рН сказывается на флуоресценции тех веществ, в молекулах которых имеются функциональные группы, склонные к ки- слотно-основному взаимодействию. Например, фенол и его производные флуоресцируют в кислой среде, при ионизации фенольного гидроксила флуоресценция исчезает. Органические вещества, цвет и интенсивность флуоресценции которых изменяется при изменении рН, могут быть использованы в качестве кислотно-основных индикаторов (флуоресцеин, хинин и т.п.).

Инструментальные методы анализа При повышении температуры увеличивается вероятность безызлучательных переходов, поэтому интенсивность флуоресценции уменьшается. Однако, у некоторых веществ свечение прекращается уже при -100 ° С, другие продолжают слабо флуоресцировать даже при >100 ° С. Если поместить флуоресцирующее вещество в специальную среду и охладить до температуры кипения жидкого азота (или даже жидкого гелия), то можно добиться того, что спектр флуоресценции органического вещества станет линейчатым. Такое явление называется эффектом Шпольского . Использование данного эффекта значительно повышает избирательность анализа и снижает предел обнаружения. Интенсивность флуоресценции вещества и её квантовый выход могут снижаться в присутствии в растворе других веществ, называемых тушителями . Существуют, так называемые, универсальные тушители (например, O 2 ), которые уменьшают флуоресценцию большинства веществ. Однако, чаще тушитель влияет на флуоресценцию одного вещества и не влияет на флуоресценцию другого (например, хлориды уменьшают интенсивность флуоресценции хинина), поскольку эффект тушения в разных случаях имеет различный механизм. Влияние концентрации тушителя на интенсивность флуоресценции вещества описывается уравнением Штерна-Фольмера I I q = 1 + kC q где I q — интенсивность флуоресценции в присутствии тушителя, С q — концентрация тушителя, k — константа тушения.

21.2.5. Измерение аналитического сигнала

Для измерения интенсивности флуоресценции используют спектрофлуориметры и флуориметры (на рис. 21.5). В качестве источника излучения используют ртутную, ксеноновую и другие лампы. В последнее время для возбуждения флуоресценции применяют лазеры. Для выделения нужного спектрального интервала в флуориметрах, как и в фотоэлектроколориметрах, используют светофильтры, а в спектрофлуориметрах, также как и в спектрофотометрах — монохроматоры (дифракционные решётки или призмы). Светофильтр (монохроматор), используемый для выделения необходимого возбуждающего излучения, называется первичным , а для выделения наиболее интенсивного излучения из спектра испускания — вторичным .

Раздел 3
устройство для выделения
	источник
		спектрального интервала
излучения
	из возбуждающего излучения

устройство для выделения спектрального интервала из испускаемого излучения регистрирующее детектор устройство Рис. 21.5. Принципиальная схема прибора для измерения интенсивности флуоресценции Измерение флуоресценции, в отличие от измерения поглощения, чаще всего проводят под прямым углом к направлению возбуж- дающего света . Такой приём позволяет избежать наложения возбуждающего света на излучаемый. При измерении интенсивности фосфоресценции, либо при большом Стоксовом сдвиге, можно использовать схему, при которой источник возбуждения, образец и детектор находятся на одной оптической оси. В данном случае возбуждающий свет не мешает определению, так как при измерении интенсивности фосфоресценции измерение проводят после прекращения действия возбуждающего света, а при большом Стоксовом сдвиге λ возб и λ исп настолько различаются, что возбуждающий свет задерживается монохроматором и не попадает на детектор. В случае сильно поглощающих растворов, полупрозрачных и твёрдых образцов используют фронтальный способ, при котором измерение флуоресценции проводится под углом 45 ° относительно возбуждающего излучения. При измерении флуоресценции имеют дело со слабым излучением, поэтому в качестве детектора используют не фотоэлементы, как в спектрофотометрии, а фотоумножители. 21.2.6. Практическое применение и основные приёмы люминесцентного анализа К люминесцентной спектроскопии относят: • флуоресцентный метод анализа ( флуориметрия ), • фосфоресцентный метод анализа (фосфориметрия ), • хеми- и биолюминесцентный метод анализа ( люминометрия ) и др.

Инструментальные методы анализа Наиболее широкое применение среди перечисленных люминесцентных методов анализа имеет флуориметрия. По сравнению со спектрофотометрией флуориметрия обладает: • большей избирательностью (не все вещества, поглощающие УФ- и видимое излучение, способны флуоресцировать); • более низким пределом обнаружения (измерить абсолютную величину малого сигнала всегда легче, чем разность между двумя большими сигналами); • удобным временным диапазоном . Поглощение света — это практически мгновенный процесс (10 -15 — 10 -16 с), флуоресценция длится около 10 нс (а фосфоресценция значительно дольше). За это время с молекулой могут произойти различные процессы, которые влияют на характеристики флуоресценции. Данное свойство широко используется в биохимии для изучения строения мембран, диффузии биомолекул, динамики связывания антигенов и антител. Влияние вращения молекул антигенов (лекарств, ядов), меченых флуоресцеином, на поляризацию флуоресценции последнего лежит в основе поляризационного флуороиммуноанализа , одного из современных методов анализа биологических объектов. Флуоресцентный анализ используют для обнаружения и для количественного определения веществ. В качественном анализе чаще всего используется способность вещества флуоресцировать тем или иным цветом. При этом в качестве источника возбуждения обычно используют УФ-лампу, а наличие или отсутствие флуоресценции определяют визуально. Таким образом, например, обнаруживают флуоресцирующие вещества на плоскостных хроматограммах. В количественном анализе используют зависимость интенсивности флуоресценции от концентрации флуоресцирующего вещества либо, реже, зависимость уменьшения интенсивности флуоресценции от концентрации тушителя, в роли которого выступает вещество, концентрацию которого необходимо определить. В флуоресцентном анализе используется: • измерение собственной флуоресценции вещества ; • получение флуоресцирующих продуктов, в том числе и экстракционная флуориметрия ; • определения, основанные на тушении флуоресценции ; • титрование с флуоресцентными индикаторами и др. Флуориметрическое определение, основанное на собственной флуоресценции, используется для определения хинина, берберина, рибофлавина, фторхинолонов, флуоресцеина и т.д.

HO	HO
N
	HO
H 3 CO		хинин
	OH
O
	HO
N		F	COOH
	H 3 C			N N	O
N	H 3 C N N		O	N
	H 3 C	N		H	CH 3
рибофлавин O
	офлоксацин

Обратите внимание на особенности структуры флуоресцирующих веществ – наличие в составе их молекул конденсированных ароматических систем. В основе реакций получения флуоресцирующих продуктов могут лежать различные процессы: окисления, конденсации, образование комплексных соединений, ионных ассоциатов и др. Если образующийся продукт мало растворим в воде, неустойчив в водном растворе, либо избыток реагента мешает определению или влияет на устойчивость продукта, применяют экстракционную флуориметрию . Иногда вещество не флуоресцирует или слабо флуоресцирует в водной среде, но интенсивно флуоресцирует в среде органического растворителя.

экстракт флуоресцирует ярко	экстракция бутанолом
голубым светом (430-435 нм )

N	N	CH 3		N	CH 3
		K 3 [Fe(CN) 6 ]	N
H 3 C N NH 2 S CH 2 CH 2 OH				H 3 C N N S CH 2 CH 2 OH
тиамин	тиохром

Флуориметрическое определение, основанное на тушении флуоресценции, применяют для определения сульфаниламидов (тушат флуоресценцию 9-хлоракридина), β -лактамных антибиотиков (тушат флуоресценцию меркурохрома) и т.д. К новым подходам в люминесцентной спектроскопии относятся: • производная спектрофлуориметрия ; • синхронная спектрофлуориметрия ; • спектроскопия, основанная на эффекте Шпольского ; • флуоресцентная спектроскопия узких линий , • фосфориметрия при комнатной температуре и др.

В чем измеряется интенсивность флуоресценции

Рэлеевское рассеяние света (РР) происходит во время прохождения лазерного излучения через газовую среду. Частота рассеянного излучения не отличается от частоты падающего. Интенсивность определяется формулой I_РР~(n-1) 2 I_ЛN, где N — числовая плотность газа, I_Л — интенсивность лазерного излучения, n — показатель преломления исследуемого газа в стандартных условиях. Значение показателя преломления для смеси газов n_смеси определяется по формуле (n_смеси-1) 2 = Sa _i(n_i-1) 2 , где a _i — мольная доля i-го компонента, предполагается суммирование по всем компонентам газовой смеси. Для измерений этим методом свет, рассеянный под некоторым углом из небольшого участка сфокусированного лазерного пучка, имеющего произвольную длину волны, проектируется на входную щель монохроматора или на интерференционный фильтр и, пройдя его, регистрируется фотоумножителем. С применением импульсных лазеров РР позволяет измерять в однородной среде мгновенные значения плотности, а при постоянном давлении — температуры. При изучении пламени метод может быть применим лишь в случаях, когда состав газов известен. Измерения методом РР могут быть затруднены в потоках, содержащих частицы (пыль, сажа), из-за возникновения на них сильного рассеяния.

Лазерно-индуцированная флуоресценция (ЛИФ) это излучение фотонов молекулами, возбужденными воздействием лазерного излучения. В методе ЛИФ используется та же схема рассеяния, что и в РР, но для возбуждения применяют лазер с перестраиваемой длиной волны. Обычно с помощью ультрафиолетового излучения лазера на красителях, полученного в режиме удвоения или суммирования частоты, возбуждают ЛИФ промежуточных продуктов химических реакций — радикалов OH, CH, NO и др. Спектр возбуждения записывают перестраивая длину волны лазера в необходимом диапазоне и регистрируя флуоресценцию в широкой полосе. Интенсивность флуоресценции пропорциональна плотности мощности лазерного излучения (P/A), концентрации радикалов (N) и ослаблена процессами тушения возбужденного состояния: I_ЛИФ~(P/A)NR_Q -1 , где скорость тушения флуоресценции R_Q= S _(i)n_i s _iv_i. Здесь n_i, s _i и v_i — концентрация, сечение тушения и относительная скорость для i-го компонента. По форме спектра ЛИФ можно вычислить температуру газа, потому что он отражает распределение населенностей уровней исследуемых радикалов. А по интенсивности линий можно определить концентрации радикалов при условии, что имеется дополнительная информация о составе газа в точке измерений и сечениях тушения основными компонентами.

Более удобен для измерения концентрации радикалов метод ЛИФ с насыщением, которое достигается использованием высокой плотности мощности лазерного излучения. В поле мощного лазерного излучения определяющими оказываются вынужденные переходы из верхнего состояния, скорость которых гораздо выше, чем спонтанных и медленные процессы тушения оказываются несущественными. Населенности уровней, связанных излучением, выравниваются. Конечно, система сбора флуоресценции должна исключить не дающие насыщения краевые пространственные области лазерного пучка, а система регистрации обеспечить выборку сигнала в момент максимальной интенсивности лазерного импульса.

Когерентное антистоксово рассеяние света (КАРС) это четырехфотонный процесс, основанный на эффекте Рамана. Первоначально эффект использовался в методе спонтанного комбинационного рассеяния (СКР) опять в той же схеме рассеяния, что РР и ЛИФ. Под действием лазерного излучения с фиксированной длиной волны происходят двухфотонные процессы рассеяния света на молекулах вещества. При этом энергии рассеянных фотонов отличаются от энергии падающих на величину колебательной (вращательной) энергии молекул. А в спектре рассеянного света присутствуют линии, сдвинутые в длинноволновую (стоксову) и коротковолновую (антистоксову) области. Молекулы разных газов (N₂, O₂, H₂, H₂0, CO₂ и др.) обладают своим характерным набором линий СКР. Интенсивности линий прямо пропорционально зависят от концентрации исследуемого компонента газовой смеси и от интенсивности лазерного излучения. Однако, низкая эффективность спонтанного рассеяния (приблизительно на три порядка ниже, чем у РР) является непреодолимым недостатком СКР и сильно ограничивает его область применения.

Метод КАРС позволяет получить высокую интенсивность сигнала комбинационного рассеяния за счет усложнения аппаратуры. В методе КАРС используют два лазера: один с фиксированной частотой — другой с перестраиваемой. Настройка разностной частоты на частоту молекулярных колебаний приводит к быстрому согласованию фаз колебаний у всех молекул, находящихся в области «накачки». Дальнейшее рассеяние на них третьего — пробного пучка, в качестве которого используют часть излучения первого лазера, происходит с возросшей на несколько порядков эффективностью. Интенсивность антистоксова сигнала выражается формулой: I_КАРС~I₁I₂I₃| c (3) | 2 . Здесь | c (3) | 2 — нелинейная кубичная восприимчивость вещества, которая определяется различными параметрами исследуемого газа, в т.ч. температурой и концентрацией молекул. Рассеянный свет распространяется в виде узконаправленного когерентного пучка, подобно лазерному, который практически не подвержен влиянию паразитной засветки из области измерений. Применение схем неколлинеарного расположения пучков позволяет избавиться также от лазерной засветки. Широкополосное возбуждение и регистрация спектров позволяет наиболее полно использовать возможности метода и проводить импульсные измерения параметров в сложных условиях, где невозможно применение других методов диагностики.

1.6.2. Измерение спектров отражения, пропускания, прозрачности, люминесценции и возбуждения излучения

Наука о методах фотометрирования потоков оптического излучения в зависимости от длины волны называется спектрофотометрией. Она включает в себя фотометрию, спектрометрию и метрологию.

Измерения таких фотометрических параметров как коэффициент направленного пропускания или зеркального отражения относительно просты и основаны на том, что в пучок падающего излучения вводят образец, и относят поток, прошедший через него (или соответственно отражённый от него), к падающему потоку при отсутствии образца.

При диффузном отражении или пропускании необходимо собрать все лучи, рассеянные по разным направлениям. В этом случае для измерения коэффициентов пропускания и отражения часто применяют интегрирующий фотометрический шар, имеющий диффузно отражающую белую внутреннюю поверхность.

Подобные шары используют и для измерения светового потока от источника излучения (источник излучения помещают внутрь шара). Идея эксперимента заключается в том, что освещённость, создаваемая многократными отражениями внутри шара, равномерно распределяется по его внутренней поверхности и прямо пропорциональна полному световому потоку. Если какую-либо точку внутренней поверхности шара защитить от прямого попадания лучей от источника, то её освещённость будет прямо пропорциональна его полному световому потоку. Проводя поочерёдно измерения с эталонным и исследуемым образцом по отношению полученных освещённостей можно рассчитать световой поток от образцового источника.

Спектрометрия включает в себя разнообразные спектральные приборы, являющиеся составной частью спектрофотометра.

В целом в состав спектрофотометра входят: источник оптического излучения, устройство для выделения необходимых спектральных интервалов (монохроматор или набор светофильтров), фотоприемник, и система регистрации сигнала. Система регистрации может быть одноканальной (обычно строится на базе монохроматора, в котором сканирование осуществляется поворотом дифракционной решетки или призмы) или многоканальной (сканирование не применяется, а дискретный ряд длин волн в полихроматорах или участки непрерывного спектра в спектрографах регистрируются одновременно). Во всех современных серийных спектрофотометрах монохроматор располагают между источником света и образцом, чтобы свести к минимуму фотохимическое действие зондирующего излучения.

При измерении спектров поглощения обычно получают кривые, на которых по оси абсцисс откладывается длина волны или волновое число, а по оси ординат — прозрачность или оптическая плотность.

Одним из важных факторов устранения ошибок при спектрофотометрических измерениях является выбор диапазона значений измеряемого сигнала. Поскольку для определения прозрачности, оптической плотности или пропускания сравниваются два сигнала, важно, чтобы их разность значительно превышала уровень шумов.

Для корректного определения величин D и T очень важно учитывать влияние отраженного и рассеянного образцом и элементами аппаратуры света. На приемник кроме излучения измеряемой длины волны всегда, в той или иной мере, попадает отраженное или рассеянное оптическими деталями прибора излучение других длин волн (как правило из максимума излучения источника света). Минимальным уровнем рассеянного света обладают спектрофотометры, оборудованные двойными монохроматорами, особенно с комбинированным призменно-решеточным диспергирующим устройством (типа Shimadzu mod. UV-365). Однако не следует обольщаться высокими паспортными возможностями приборов (самые современные характеризуются диапазоном оптических плотностей вплоть до D=5). Если не приняты все меры для сведения к минимуму влияния побочного (рассеянного) света, пропущенного монохроматором на тех длинах волн, где исследуемый объект не поглощает, то измеренные значения оптической плотности и прозрачности могут оказаться очень далеки от истинных.

Доля рассеянного света (i) становится особенно большой в той спектральной области измерений, где мала чувствительность фотоприемника или яркость источника и наиболее сильно проявляется при регистрации интенсивных полос поглощения. При этом измеряемая оптическая плотность D B _reg _B оказывается меньше истинной D:

Рассеяние света в объеме и на поверхности исследуемых образцов, а также их фотолюминесценция, вносят дополнительные искажения в наблюдаемые спектры поглощения. Рассеяние света образцом приводит к искажению формы спектров и к неверному определению величины оптической плотности.

Измерение спектров люминесценции

Отличие флуоресцентной спектроскопии от других спектроскопических методик состоит в том, что регистрируемая спектральная зависимость является функцией двух переменных — длины волны возбуждения l B _ex _B и длины волны испускания l B _em _B . Если l B _ex _B поддерживается постоянной, а l B _em _B сканируется, то измеряется спектр флуоресценции I( l B _em _B ) (спектральная зависимость интенсивности флуоресцентного испускания от длины волны). Если сканируется l B _ex _B при постоянной l B _em _B , то получается спектр возбуждения флуоресценции I( l B _ex _B ) (спектральная зависимость эффективности возбуждения флуоресценции от длины волны). При графическом изображении спектров испускания (или возбуждения) флуоресценции по оси абсцисс откладывают длину волны (в нанометрах) или волновое число (в см P -1 P ), а по оси ординат — интенсивность флуоресценции I B _fl _B (в произвольных единицах). Если оптическое поглощение света достаточно мало, а спектральное распределение возбуждающего света учитывается корректно, спектр возбуждения будет близок по форме к спектру поглощения.

У жидких растворов индивидуальных органических молекул, как правило, форма спектра испускания флуоресценции не зависит от длины волны возбуждения. Форма полосы истинного спектра флуоресценции молекулярного раствора в большинстве случаев зеркально симметрична наиболее длинноволновой полосе поглощения. Как правило эти полосы перекрывются друг с другом в некотором спектральном диапазоне.

При возбуждении в самый длинноволновый край спектра поглощения, спектры флуоресценции твердых молекулярных растворов испытывают смещение.

Для исследования спектрального распределения света, испускаемого образцом, предназначены спектрофлуориметры. На этих приборах можно также измерять изменения интенсивности испускания в зависимости от длины волны возбуждения (спектры возбуждения флуоресценции).

Спектрофлуориметр состоит из следующих основных устройств: источника возбуждающего света; устройств для выделения спектральных интервалов возбуждения люминесценции и ее регистрации (в наиболее универсальных приборах это монохроматоры); фотоприемника с электронной системой регистрации сигнала.

Пропускание монохроматоров и чувствительность фотоприемников зависят от длины волны. Поэтому, для получения истинного относительного распределения интенсивностей в спектрах флуоресценции, измеренные зависимости тока фотоприемника от длины волны должны быть скорректированы на калибровочную функцию (спектральная чувствительность прибора). В противном случае измеренные спектральные распределения не будут соответствовать истинным спектрам флуоресценции. В большинстве современных спектрофлуориметров исправление спектров происходит автоматически. Спектры, полученные на разных приборах, ни в коем случае нельзя сопоставлять, если нет уверенности, что они скорректированы на спектральную чувствительность аппаратуры.

Особенностью спектрофлуориметрии является то, что флуоресцентное излучение возникает во внутреннем объеме образца и изотропно распространяется по всем направлениям (в полном телесном угле 4 p ). Условия сбора этого излучения на фотоприемник и геометрическая форма образцов сильно сказываются на интенсивности регистрируемых спектров флуоресценции. Нарушение условий изотропности в оптическом тракте или образце могут привести к изменению их спектральной формы.

Флуоресценция крайне чувствительный метод. Поэтому сильные искажения спектров могут быть вызваны рассеянием света в образце и (или) присутствием в нем даже незначительных количеств примесей. Примеси могут приводить как к искажению истинных спектральных зависимостей вкладом своей люминесценции, так и к уменьшению интенсивности свечения вплоть до полного тушения. Какая-либо компенсация этих эффектов или их учет по измерениям эталонных образцов, не содержащих исследуемого люминесцирующего соединения невозможны.

Даже в условиях полного отсутствия искажающих факторов, экспериментально измеренные спектральные зависимости далеко не всегда соответствуют истинным спектрам флуоресценции. Их интенсивность может зависеть от геометрической схемы регистрации флуоресценции по отношению к направлению возбуждающего светового пучка.

Такое поведение флуоресценции, наряду с геометрией эксперимента, обусловлено двумя эффектами: поглощением возбуждающего света и света собственной флуоресценции в объеме образца. Первый эффект называют эффектом внутреннего фильтра, а второй — реабсорбцией или вторичным поглощением. Обсудим их подробнее.

Эффект внутреннего фильтра наблюдается при высоких оптических плотностях и заключается в том, что интенсивность возбуждающего света в объеме образца удаленном от источника света меньше, чем в ближайшем к источнику объеме. Передние слои образца работают как фильтр, поглощающий большую часть возбуждающего света. Освещенность образца становится неравномерной, а интенсивность люминесценции уменьшается. При очень больших концентрациях возбуждающий свет поглощается практически полностью, и флуоресценция может наблюдаться только из тонкого приповерхностного слоя. Форма спектра флуоресценции может и не искажаться, если достаточно мала оптическая плотность в области перекрывания спектров поглощения и флуоресценции или перекрывание незначительно. Эффект внутреннего фильтра может быть вызван любыми поглощающими свет компонентами образца, включая растворитель (полимерную основу) и примеси. Искажения формы спектров флуоресценции за счет внутреннего фильтра будут наблюдаться, если поглощение этих компонент лежит в спектральной области исследуемой флуоресценции.

Если спектры поглощения и флуоресценции перекрываются и оптическая плотность образца в области перекрывания велика, то наблюдается поглощение света собственной флуоресценции самим флуоресцирующим компонентом — реабсорбция или вторичное поглощение. Эффект реабсорбции, наряду с уменьшением интенсивности флуоресценции, всегда приводит к искажению формы спектров. При этом нарушается зеркальная симметрия спектров поглощения и флуоресценции. Это обусловлено тем, что реабсорбция вызывает искажения формы спектра флуоресценции исключительно в области его перекрывания со спектром поглощения. В результате этих искажений постепенно, с ростом оптической плотности образца в этой области (например, за счет увеличения концентрации флуоресцирующего компонента), исчезает коротковолновая (для многих люминофоров обладающая разрешенной колебательной структурой) часть спектра флуоресценции. Искажения становятся тем больше, чем больше оптическая плотность флуоресцирующего компонента в области перекрывания спектров. В конечном счете, от истинного спектра флуоресценции остается лишь длинноволновый бесструктурный хвост, расположенный практически вне области собственного поглощения флуоресцирующего компонента. Спектральный максимум этого бесструктурного образования может оказаться на десятки нанометров смещенным относительно положения максимума истинного спектра.

Явление реабсорбции обусловлено как люминесцентными свойствами вещества, так и методическими особенностями измерения флуоресценции. Как уже упоминалось выше, квантовый выход люминесценции всегда меньше единицы и часть поглощенного молекулой света расходуется безызлучательно. Это означает, что с каждым актом вторичного поглощения кванта флуоресценции интенсивность последующего флуоресцентного излучения уменьшается. С другой стороны, в изотропной среде молекулы испускают флуоресценцию в полный телесный угол 4 p . Тогда как технические возможности флуориметров позволяют собирать на фотоприемник свет в телесном угле с раствором 30 P 0 P -40 P о P , что составляет лишь около 10% полного испускания. Учитывая угол светосбора и тот факт, что каждая вторично поглотившая квант света люминесценции молекула переизлучает его в сферу с интегральной интенсивностью определяемой квантовым выходом, нетрудно видеть, что в каждом акте вторичного испускания регистрируемая интенсивность флуоресценции уменьшается более чем в десять раз.

Кажущиеся изменения формы спектров и спектральные сдвиги, обусловленные тривиальным эффектом реабсорбции, неискушенным исследователем вполне могут быть интерпретированы за счет структурных изменений в образце. Например, проявление реабсорбции может быть интерпретировано, как разгорание сенсибилизированной флуоресценции в результате переноса энергии с донора на акцептор или ошибочно отнесено к образованию эксимеров. Поэтому при измерениях флуоресценции всегда следует помнить, что искажения интенсивности и формы полос спектров флуоресценции пренебрежимо малы только в случаях, когда оптическая плотность образца в области перекрывания спектра поглощения флуоресцирующего компонента со спектром его испускания (можно назвать эту величину “оптической толщиной” образца) не превышает значений 0,01-0,05. При таких оптических плотностях практически не проявляется и эффект внутреннего фильтра. Требования к этому фактору для примесей не столь жесткие, если нужно измерить только форму спектров флуоресценции, а не их интенсивность, и поглощение примесей не попадает в полосу флуоресценции. В измерениях квантового выхода люминесценции учет примесного фактора необходим.

Как видим, корректное измерение спектров люминесценции возможно лишь при малых оптических плотностях. Подбор требуемой величины оптической плотности возможен за счет уменьшения концентрации люминесцирующей компоненты в образе или за счет уменьшения толщины слоя. Однако в последнем случае далеко не всегда удается устранить проявление реабсорбции. В тонких слоях растворов (толщиной 1мм) с оптической плотностью порядка 0,04 отчетливо наблюдался эффект реабсорбции. Устранение полного внутреннего отражения уменьшало эффект лишь вдвое. Наилучший эффект был получен при ограничении поперечных размеров возбуждающего пучка. В этом случае наблюдали десятикратное уменьшение вклада реабсорбции, практически пропорциональное уменьшению площади возбуждения. Это явление можно объяснить объемной реабсорбцией флуоресценции, распространяющейся вдоль поглощающего слоя (в направлении перпендикулярном возбуждающему пучку). С уменьшением толщины слоя возрастает роль реабсорбции за счёт полного внутреннего отражения.

Контрольные вопросы

1. Что называют спектрофотометрией?

2. Как проводят определение коэффициента направленного пропускания и отражения?

3. Опишите работу интегрирующих фотометрических шаров.

4. Что входит в состав спектрофотометра?

5. Что необходимо учитывать при корректном определении оптической плотности и прозрачности среды?

6. В чём заключается отличие флуоресцентной спектроскопии от других спектральных методик?

7. Из каких основных элементов состоит спектрофлуориметр?

8. В чём заключается эффект внутреннего фильтра?

9. Что такое вторичное поглощение в флуоресцентном анализе объекта?

RU2536045C2 — Способ измерения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуоресцентного красителя — Google Patents

Publication number RU2536045C2 RU2536045C2 RU2012122181/04A RU2012122181A RU2536045C2 RU 2536045 C2 RU2536045 C2 RU 2536045C2 RU 2012122181/04 A RU2012122181/04 A RU 2012122181/04A RU 2012122181 A RU2012122181 A RU 2012122181A RU 2536045 C2 RU2536045 C2 RU 2536045C2 Authority RU Russia Prior art keywords potential sensitive voltage fluorescence intensity fluorochrome Prior art date 2009-10-30 Application number RU2012122181/04A Other languages English ( en ) Other versions RU2012122181A ( ru Inventor Фумиюки ХАТТОРИ Кейити ФУКУДА Ю-суке САТОХ Original Assignee Дайити Санкио Компани, Лимитед Кейо Юниверсити Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.) 2009-10-30 Filing date 2010-10-29 Publication date 2014-12-20 2010-10-29 Application filed by Дайити Санкио Компани, Лимитед, Кейо Юниверсити filed Critical Дайити Санкио Компани, Лимитед 2013-12-10 Publication of RU2012122181A publication Critical patent/RU2012122181A/ru 2014-12-20 Application granted granted Critical 2014-12-20 Publication of RU2536045C2 publication Critical patent/RU2536045C2/ru

Images

Classifications

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N21/00 — Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
G01N21/62 — Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
G01N21/63 — Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
G01N21/64 — Fluorescence; Phosphorescence
G01N21/6428 — Measuring fluorescence of fluorescent products of reactions or of fluorochrome labelled reactive substances, e.g. measuring quenching effects, using measuring «optrodes»

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N21/00 — Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
G01N21/75 — Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated
G01N21/77 — Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator
G01N21/78 — Systems in which material is subjected to a chemical reaction, the progress or the result of the reaction being investigated by observing the effect on a chemical indicator producing a change of colour

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N21/00 — Investigating or analysing materials by the use of optical means, i.e. using sub-millimetre waves, infrared, visible or ultraviolet light
G01N21/62 — Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light
G01N21/63 — Systems in which the material investigated is excited whereby it emits light or causes a change in wavelength of the incident light optically excited
G01N21/64 — Fluorescence; Phosphorescence

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N27/00 — Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means
G01N27/26 — Investigating or analysing materials by the use of electric, electrochemical, or magnetic means by investigating electrochemical variables; by using electrolysis or electrophoresis
G01N27/416 — Systems

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N33/00 — Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 — G01N31/00
G01N33/48 — Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
G01N33/50 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
G01N33/58 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
G01N33/582 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with fluorescent label

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N33/00 — Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 — G01N31/00
G01N33/48 — Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
G01N33/50 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
G01N33/68 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
G01N33/6872 — Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N33/00 — Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 — G01N31/00
G01N33/48 — Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
G01N33/50 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
G01N33/82 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving vitamins or their receptors

G — PHYSICS
G01 — MEASURING; TESTING
G01N — INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
G01N33/00 — Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 — G01N31/00
G01N33/48 — Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
G01N33/50 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
G01N33/92 — Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving lipids, e.g. cholesterol, lipoproteins, or their receptors

Abstract

Изобретение относится к способу измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, который включает добавление к потенциалочувствительному флуорохрому ионизирующегося соединения для вызова изменения потенциала или ионной силы, а также добавление витамина Е и/или холестерина для увеличения изменения потенциала или ионной силы по потенциалочувствительному флуорохрому. Также изобретение относится к способу измерения потенциала действий культивируемых кардиомиоцитов. Настоящее изобретение обеспечивает измерение интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов или потенциалозависимые количественные изменения интенсивности их флуоресценции без использования таких материалов (мембранных носителей), как клетки или липидные бислойные липосомы. 2 н. и 8 з.п. ф-лы, 3 пр., 5 ил.

Description

ОБЛАСТЬ ТЕХНИКИ

[0001] Настоящее изобретение относится к способу, в котором используется витамин E и/или холестерин для увеличения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, которые излучают флуоресценцию в ответ на изменение потенциала или ионной силы, (т.е. для сенсибилизации флуорохромов), или способу увеличения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов. Настоящее изобретение также относится к способу измерения потенциала действия культивируемых кардиомиоцитов, используя системы измерения, которые были сенсибилизированы или в которых была увеличена интенсивность посредством использования витамина E и/или холестерина. Настоящее изобретение, кроме того, относится к способу, в котором используется потенциалочувствительный флуорохром, образующий твердую фазу на поверхностях подложки, так что изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому можно измерить независимо от того, используется ли мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы. Настоящее изобретение также относится к способу отбора вещества, которое увеличивает процент изменения потенциалозависимой или зависимой от изменения ионной силы интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов, или которое увеличивает интенсивность флуоресценции.

ПРЕДПОСЫЛКИ СОЗДАНИЯ ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0002] Аритмия является заболеванием, которое не только значительно понижает качество жизни пациентов, но которое также иногда угрожает их жизни. При разработке лекарственных средств от различных заболеваний необходимым является выявление и избегание любых побочных эффектов (например, аритмии), которые, бывает, влияют на электрические активности кардиомиоцитов. До сих пор животные и кардиомиоциты животного происхождения использовались с целью разработки антиаритмических средств и их проверки на любые действия, которые, бывает, влияют на электрические активности кардиомиоцитов. Однако вследствие вовлеченных межвидовых различий такой подход не был практически осуществимым способом, который можно использовать в случае людей (непатентный документ 1: Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 385, p. 497-502, 2009).

[0003] Недавние разработки ES клеток человека и iPS клеток человека показали, что кардиомиоциты человека можно получить посредством дифференцировки этих клеток. Способ, с помощью которого можно легко получить информацию о потенциале действия кардиомиоцитов человека, используя эти клетки, будет играть важную роль в связанной с обнаружением лекарственных средств деятельности. В нынешних условиях использование потенциалочувствительных флуорохромов, как предполагают, обеспечит способ измерения потенциалов действий таких кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток или iPS клеток человека; однако проблемой, связанной с анализом, используя потенциалочувствительные флуорохромы, является то, что, независимо от того, происходят ли кардиомиоциты от ES клеток человека или iPS клеток человека, было невозможным измерение потенциалов их действий вследствие недостаточности чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов.

[0004] Дополнительной проблемой, связанной с ранее используемыми потенциалочувствительными флуорохромами, является то, что измерение потенциала возможно только, когда они связаны с мембранными носителями, такими как клетки или липидные бислойные липосомы. Если быть точнее, для измерения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов необходимо было выполнять эксперимент после обработки потенциалочувствительных флуорохромов в водном растворе для образования твердой фазы на мембранном носителе, таком как клетки или липидные бислойные липосомы, но это делало необходимым приготовление клеток или липидных бислойных липосом в качестве мембранного носителя. Поскольку в этом подходе требуется приготовление липидных бислойных липосом или использование клеток в качестве мембранного носителя, экспериментальная система станет не только сложной, но на нее будут также влиять различные мешающие артефакты.

СПИСОК ПРОТИВОПОСТАВЛЕННЫХ МАТЕРИАЛОВ
НЕПАТЕНТНЫЕ ДОКУМЕНТЫ
[0005] Непатентный документ 1: Biochem. Biophys. Res. Commun., Vol. 385, p. 497-502, 2009
КРАТКОЕ ИЗЛОЖЕНИЕ СУЩНОСТИ ИЗОБРЕТЕНИЯ
ТЕХНИЧЕСКАЯ ПРОБЛЕМА

[0006] Целью настоящего изобретения является обеспечение способа увеличения изменения интенсивности флуоресценции, излучаемой потенциалочувствительным флуорохромом, в зависимости от изменения потенциала или ионной силы и/или способа увеличения интенсивности флуоресценции в зависимости от потенциала или ионной силы.

Другой целью настоящего изобретения является измерение изменений потенциалов действий происходящих из ES клеток или iPS клеток кардиомиоцитов, которые ранее было невозможно измерить.

Дальнейшей целью настоящего изобретения является обеспечение того, чтобы интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов или потенциалозависимые количественные изменения интенсивности их флуоресценции можно было легко измерить без использования таких материалов (мембранных носителей), как клетки или липидные бислойные липосомы.

Еще одной целью настоящего изобретения является разработка способа скрининга для обнаружения вещества, которое увеличивает интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов.

РЕШЕНИЕ ПРОБЛЕМЫ

[0007] Авторы настоящего изобретения скринировали ряд веществ и установили, что витамин E выполняет функцию увеличения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, тогда как и витамин E, и холестерин выполняют функцию увеличения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов. Кроме того, стало ясно, что эти вещества можно скомбинировать таким образом, чтобы витамин E увеличивал чувствительность потенциалочувствительного флуорохрома при увеличении в то же самое время абсолютной величины интенсивности его флуоресценции с помощью и холестерина, и витамина E (или комбинации холестерина и витамина E). На основе этих обнаружений авторы настоящего изобретения осуществили настоящее изобретение, которым обеспечивается способ измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, в котором к потенциалочувствительному флуорохрому добавляют ионизирующееся соединение для вызова изменения потенциала или ионной силы, а также добавляют витамин E и/или холестерин для увеличения изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому.

[0008] Авторы настоящего изобретения также показали, что в результате использования описанного выше действия для сенсибилизации потенциалочувствительных флуорохромов, чтобы увеличить интенсивность их флуоресценции, можно было выполнить ранее невозможное измерение потенциалов действий единичных клеток, таких как происходящие из ES клеток или iPS клеток кардиомиоциты, при этом дополнительным преимуществом являлось предоставление возможности измерений изменений потенциала действия в специфических областях клеток. На основе этих обнаружений авторы настоящего изобретения предоставляют способ измерения потенциала действия культивируемых кардиомиоцитов, в котором потенциалочувствительный флуорохром приводят в контакт с кардиомиоцитами, культивируемыми в культуральной среде, в культуральную среду добавляют витамин E и/или холестерин и измеряют изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.

[0009] Авторами настоящего изобретения было, кроме того, сделано новое открытие, что потенциалочувствительные флуорохромы можно адсорбировать с образованием твердой фазы на поверхностях подложек, таких как пластмассовые или стеклянные поверхности. Это открытие основано на обнаружении того, что потенциалочувствительные флуорохромы являются веществами, которые можно легко адсорбировать на поверхностях подложек, таких как пластмассовые или стеклянные поверхности. Используя образованную таким образом твердую фазу потенциалочувствительных флуорохромов, авторы настоящего изобретения с успехом разработали систему, с помощью которой изменения потенциала или ионной силы можно измерить очень легко и последовательным и высоко-воспроизводимым образом даже в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы. На основе этого обнаружения авторы настоящего изобретения предоставляют способ измерения изменений потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, в котором потенциалочувствительный флуорохром иммобилизуют на поверхности подложки в растворе, к раствору добавляют ионизирующееся соединение для придания потенциала или вызова изменения ионной силы и измеряют изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.

[0010] В еще одном варианте настоящего изобретения его авторы, основываясь на обнаружении того, что при использовании специфических веществ можно увеличить чувствительность флуоресценции от потенциалочувствительных флуорохромов или абсолютную величину интенсивности их флуоресценции, и что изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительным флуорохромам можно также измерить независимо от того, используется ли мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, продемонстрировали возможность скрининга на вещества, способные увеличивать чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, или вещества, способные увеличивать абсолютные величины интенсивности их флуоресценции. На основе этих данных наблюдений авторы настоящего изобретения предоставляют способ отбора вещества, которое увеличивает процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы, включающий:

(i) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить опорное значение для потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;

(ii) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и испытываемого вещества и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить испытательное значение потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;

(iii) сравнение опорного значения, полученного в (i), с испытательным значением, полученным в (ii), и, если при одной и той же концентрации ионизирующегося соединения интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, полученная в (ii), выше интенсивности флуоресценции, полученной в (i), или если в случае по меньшей мере двух различных концентраций добавляемого ионизирующегося соединения процент увеличения интенсивности флуоресценции, полученный в (ii), выше процента увеличения, полученного в (i), отбор испытываемого вещества в качестве вещества, которое увеличивает процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы.

ПОЛЕЗНЫЕ ЭФФЕКТЫ НАСТОЯЩЕГО ИЗОБРЕТЕНИЯ

[0011] Стало ясно, что независимо от того, выполняется ли эксперимент в системе, в которой не используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, или в традиционной системе, в которой используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, чувствительность флуоресценции в зависимости от изменения потенциала или ионной силы от потенциалочувствительных флуорохромов можно увеличить с помощью витамина E, и что интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов в зависимости от изменения потенциала или ионной силы можно увеличить с помощью и витамина E, и холестерина.

КРАТКОЕ ОПИСАНИЕ ЧЕРТЕЖЕЙ

[0012] Фиг.1 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что потенциалочувствительные флуорохромы, образующие твердую фазу на поверхности подложки, излучали флуоресценцию с интенсивностями, пропорциональными ионной силе, в таких условиях, в которых не было клеток, выполняющих функцию мембранного носителя; очевидно, что независимо от материала подложки (стекла или пластмассы) или типа потенциалочувствительного флуорохрома интенсивность флуоресценции увеличивалась пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия).

Фиг.2 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что потенциалочувствительные флуорохромы, образующие твердую фазу на поверхности подложки, излучали флуоресценцию с интенсивностями, пропорциональными ионной силе, в таких условиях, в которых не было клеток, выполняющих функцию мембранного носителя; в случае Di8-ANEPPS (Фиг.2a) и RH237 (Фиг.2b) изменения интенсивности флуоресценции возникали пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия).

Фиг.3 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что витамин Е действует как вещество, способное увеличить процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. как вещество, обладающее сенсибилизирующим действием), и что и холестерин, и витамин E действуют как усилитель потенциалозависимой интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома.

Фиг.4 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что витамин E действует как вещество, способное увеличить процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. как вещество, обладающее сенсибилизирующим действием), и что и холестерин, и витамин E действуют как усилитель потенциалозависимой интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома.

Фиг.5 представляет собой набор фотографий, на которых показано, что витамин E и холестерин могут также проявлять сенсибилизирующее или усиливающее действие в отношении потенциалочувствительного флуорохрома в таких условиях, когда в качестве мембранного носителя использовались клетки.

ОПИСАНИЕ ВАРИАНТОВ ОСУЩЕСТВЛЕНИЯ

[0013] Потенциалочувствительные флуорохромы являются веществами, применимыми для измерения потенциала действия кардиомиоцитов или нейронов. Ранее сообщалось о различных веществах в качестве потенциалочувствительных флуорохромов. Традиционные способы, в которых используются потенциалочувствительные флуорохромы для анализа характеристик потенциала действия по показателю интенсивности флуоресценции, включают измерение разности потенциалов между внутренней стороной и внешней стороной клеточной мембраны, используя мембранную структуру (мембранный носитель), такую как клетки или липидные бислойные липосомы. В этих традиционных способах не используются клетки, обладающие автономной электрической активностью; а предпочтительнее используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, не обладающий электрической активностью, и с внешней стороны клетки добавляют ионизирующееся соединение для создания трансмембранной разности потенциалов; основанный на этом подходе метод обычно использовался в качестве количественного аналитического способа.

[0014] Для выполнения измерения потенциала согласно потенциалочувствительным флуорохромам используют клетки, поскольку потенциалочувствительные флуорохромы, которые первоначально предназначались для измерения трансмембранной разности потенциалов, специально разрабатывались для приобретения ими большей способности к перемещению к клеточной мембране, чтобы достичь этой цели.

[0015] Для поиска добавок, которые могли бы дать возможность выявлять изменения потенциала действия с большей чувствительностью, авторы настоящего изобретения сначала выполняли измерения в соответствии с традиционным способом, используя клетки в качестве мембранного носителя. Когда с целью увеличения интенсивности флуоресценции от потенциалочувствительного флуорохрома было добавлено большее количество потенциалочувствительного флуорохрома, увеличилась интенсивность флуоресценции на чашке для культивирования клеток, а не на клетках, а именно увеличилась интенсивность флуоресценции фона. Это необычное явление говорит об иммобилизации потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности чашки для культивирования клеток в качестве подложки. Поскольку ранее считалось необходимым подвергание потенциалочувствительного флуорохрома экспериментированию после его обработки для образования твердой фазы на мембранном носителе, таком как клетки или липидные бислойные липосомы, возможность иммобилизации потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки, такой как пластмасса, стекло и т.д., была совершенно неожиданным явлением.

[0016] Основываясь на этом обнаружении, авторы настоящего изобретения измерили изменения интенсивности флуоресценции в зависимости от концентрации добавленного ионизирующегося соединения (т.е. ионной силы) в соответствии с традиционным способом за исключением того, что потенциалочувствительный флуорохром не обрабатывали для образования твердой фазы на мембранном носителе, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, а допускали адгезию к поверхности подложки, к которой прилипают клетки, такой как пластмасса или стекло. В результате авторы настоящего изобретения установили, что даже без использования мембранного носителя, таком как клетки или липидные бислойные липосомы, интенсивность флуоресценции увеличивается зависимым от концентрации ионизирующегося соединения (т.е. ионной силы) образом. Это дало возможность легко измерять интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома и потенциалозависимое количественное изменение интенсивности флуоресценции.

[0017] Таким образом, в одном варианте настоящего изобретения его авторы показали, что в соответствии с процедурой, включающей стадии иммобилизации потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавления в раствор ионизирующегося соединения и измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, был обеспечен способ измерения изменений потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому даже в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы.

[0018] Используемый здесь потенциалочувствительный флуорохром может быть любого из типов, которые вообще имеются в распоряжении в соответствующей области техники, и подходящий потенциалочувствительный флуорохром может быть выбран из числа следующих: потенциалочувствительных флуорохромов на основе стирила, включающих ANEPPS, ANRPEQ и RH; потенциалочувствительных флуорохромов на основе цианина или оксонола, включающих DiSC, DiOC, DiIC, DiBAC и DiSBAC; и происходящего от родамина потенциалочувствительного флуорохрома, такого как Rh 123, TMRM и TMRE. В настоящем изобретении более предпочтительно использовать потенциалочувствительные флуорохромы на основе стирила, включающие ANEPPS, ANRPEQ и RH, конкретными примерами которых служат di-8-ANEPPS, di-4-ANEPPS, RH-237, RH-1691, di-5-ASP, RH-160, RH-421, RH-795, di-4-ANEPPDHQ, ANNINE-5 и ANNINE-6, и предпочтительный потенциалочувствительный флуорохром можно выбрать из их числа.

[0019] Ионизирующееся соединение, добавляемое к потенциалочувствительному флуорохрому, иммобилизованному на поверхности подложки в растворе, может быть любым веществом, которое ионизируется (превращается в йоны) в растворе. Выражаясь точнее, оно может быть ионизирующимся соединением, которое состоит только из йонов, содержащихся в биологической тканевой жидкости или внутриклеточной жидкости, таких как йон калия, натрия, кальция, бикарбонат-йон, хлорид-йон, гидроксильный йон и йон аммония. В настоящем изобретении хлорид калия, хлорид кальция или хлорид натрия могут обычно использоваться в качестве предпочтительного ионизирующегося соединения.

[0020] Поверхность подложки, такой как пластмасса или стекло, не нужно подвергать какой-либо специальной обработке; в альтернативном случае ее поверхность может быть подвергнута обработке, которая делает возможной легкую адгезию клеток. В каком угодно случае поверхность подложки впоследствии обрабатывают при подходящей концентрации потенциалочувствительного флуорохрома (скажем, 100 мкМ или менее в случае ANEPPS) в течение подходящего периода времени (скажем, 15 минут в случае ANEPPS) при подходящей температуре (скажем, 20°С в случае ANEPPS). Подвергнутую обработке поверхность подложки промывают подходящим водным раствором по меньшей мере три раза для удаления таким образом потенциалочувствительного флуорохрома, который не был иммобилизован на поверхности.

[0021] В качестве дальнейшего преимущества настоящего изобретения, используя описанный выше способ, в котором измеряются изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, измерение изменений потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому, которое традиционно выполнялось с использованием мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, стало весьма поддающимся осуществлению in vitro. Поэтому авторы настоящего изобретения применили этот способ для конкретной цели — скрининга на вещества, которые могли бы увеличить изменение интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, а также на вещества, которые могли бы облегчить выявление этого изменения интенсивности флуоресценции. Итак, в другом варианте настоящего изобретения его авторы показали, что, используя описанный выше способ, может быть обеспечен способ скрининга на вещество, которое изменяет интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома (а именно, на вещество, которое увеличивает интенсивность флуоресценции, или вещество, которое уменьшает ее), а также на вещество, которое облегчает выявление изменения интенсивности флуоресценции (а именно, вещество, которое облегчает выявление изменения в сторону увеличения интенсивности флуоресценции, или вещество, которое облегчает изменение в сторону уменьшения интенсивности флуоресценции).

[0022] Выражаясь точнее, обеспечен способ отбора вещества, которое изменяет процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы, включающий:

[0023] (i) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить опорное значение для потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;

[0024] (ii) иммобилизацию потенциалочувствительного флуорохрома на поверхности подложки в растворе, добавление в раствор ионизирующегося соединения и испытываемого вещества и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, чтобы таким образом измерить испытательное значение потенциала или ионной силы по потенциалочувствительному флуорохрому в отсутствие мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы;

[0025] (iii) сравнение опорного значения, полученного в (i), с испытательным значением, полученным в (ii), и, если при одной и той же концентрации ионизирующегося соединения интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, полученная в (ii), выше интенсивности флуоресценции, полученной в (i), или если в случае по меньшей мере двух различных концентраций добавляемого ионизирующегося соединения процент увеличения интенсивности флуоресценции, полученный в (ii), выше процента увеличения, полученного в (i), отбор испытываемого вещества в качестве вещества, которое изменяет процент изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы.

[0026] Термин «изменяют [изменяет]», используемый здесь в отношении процента изменения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от потенциала или ионной силы, может относиться либо к увеличению, либо к уменьшению процента представляющего интерес изменения. В настоящем изобретении как вещество, которое увеличивает интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, так и вещество, которое облегчает выявление увеличения интенсивности флуоресценции, являются предпочтительными.

[0027] В традиционном способе скрининга, в котором использовались клетки в качестве мембранного носителя, было трудно определить, действует ли вещество при скрининге на белки, такие как ионные каналы в клетках, или оно вызывает непосредственное взаимодействие с потенциалочувствительным флуорохромом. В отличие от этого традиционного способа, в описанном выше способе скрининга по настоящему изобретению не используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, поэтому можно отобрать вещество, которое непосредственно взаимодействует с потенциалочувствительным флуорохромом.

[0028] Авторы настоящего изобретения добавляли ряд веществ в качестве примеров испытываемого вещества, на которое делается ссылка на стадии (ii) описанного выше способа, и выясняли, увеличивает ли каждое вещество интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов, или облегчает ли оно выявление изменения интенсивности их флуоресценции. В результате, они установили, что два вещества — витамин E и холестерин, обладающие различными характеристиками, увеличивают интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов. С помощью детального исследования этого действия выявлено, что витамин E выполняет функцию увеличения чувствительности потенциалочувствительных флуорохромов, тогда как и витамин E, и холестерин выполняют функцию увеличения интенсивности флуоресценции потенциалозависимых флуорохромов.

[0029] С помощью этого способа скрининга, в котором используется экспериментальная система, в которой не используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, можно выбрать изменение интенсивности флуоресценции, которое основано на непосредственном взаимодействии потенциалочувствительного флуорохрома с испытываемым веществом. Поэтому стало ясно, что витамин E и холестерин, которым до некоторой степени оказывает помощь действие мембраны или мембранного потенциала, действуют непосредственно на потенциалочувствительный флуорохром с увеличением тем самым его чувствительности к окружающим йонам, а также интенсивности его флуоресценции.

[0030] Кроме того, ввиду свойств витамина E и холестерина нетрудно ожидать схожие функции не только от производных витамина E и производных холестерина, но также от жирорастворимых антиоксидантов, в том числе производных, таких как бутилированный гидрокситолуол, тролокс, катехин и астаксантин, соединения, описанные в известных документах (например, Advances in Drug Research, Vol. 28, 1996, pp. 65-138 and Toxicology, Vol. 180, 2002, pp. 151-167), и их производные.

[0031] В случае скрининга на вещество, которое влияет на интенсивность флуоресценции и потенциалозависимое изменение интенсивности флуоресценции, в раствор можно добавить потенциалочувствительный флуорохром, который должен образовать твердую фазу, который затем подвергают обработке описанным выше способом. Авторы настоящего изобретения произвели проверку этого способа скрининга на наличие связи между концентрацией витамина Е или холестерина и их сенсибилизирующим или усиливающим действием применительно к интенсивности флуоресценции. В результате, они установили, что витамин E, при использовании в концентрациях от 500 мкМ до 5 мкМ, может увеличить чувствительность потенциалочувствительных флуорохромов при увеличении в то же самое время интенсивности их флуоресценции. Авторы настоящего изобретения также установили, что холестерин, при использовании в концентрациях от 500 мкМ до 5 мкМ, может увеличить интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов.

[0032] Используя увеличивающие чувствительность или интенсивность флуоресценции вещества, полученные таким образом с помощью описанного выше способа скрининга, авторы настоящего изобретения, кроме того, показали, что изменения потенциала действия, которые возникают в популяции происходящих из ES клеток или iPS клеток кардиомиоцитов или в единичном происходящем из ES клетки или iPS клетки кардиомиоците, или в определенных областях таких кардиомиоцитов, можно измерить с большими чувствительностями, чем можно в традиционном способе. В частности, авторы настоящего изобретения показали, что потенциал действия культивируемых кардиомиоцитов можно измерить с большей чувствительностью, чем можно в традиционном способе, с помощью процедуры приведения потенциалочувствительного флуорохрома в контакт с кардиомиоцитами, культивируемыми в культуральной среде, добавления в культуральную среду витамина E и/или холестерина и измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.

[0033] Для измерения потенциала действия кардиомиоцитов поверхность подложки, такой как пластмасса или стекло, подвергают какой-либо подходящей для усиления адгезии клеток обработке, и кардиомиоциты подвергают адгезионному культивированию. В среду для адгезионного культивирования добавляют потенциалочувствительный флуорохром для окрашивания культивируемых клеток, а также добавляют витамин E и/или холестерин в концентрациях, составляющих от 500 мкМ до 5 мкМ. В этом случае витамин E или холестерин может использоваться независимо, или они могут использоваться в комбинации.

[0034] Для флуоресцентного анализа в настоящем изобретении может применяться любой тип флуоресцентного микроскопа, который может использоваться в соответствующей области техники, и типичным примером является IX71 (OLYMPUS Corporation). В следующих примерах IX71 (OLYMPUS Corporation) был использован в качестве флуоресцентного микроскопа и сочетан с подходящим единичным источником света, таким как ртутная лампа (OLYMPUS Corporation), или компоновкой LED (OLYMPUS Corporation). С целью фиксации флуоресцентных изображений, обработки изображений и численных расчетов в настоящем изобретении могут применяться любые модели аналитических программных средств для обработки изображений и численных расчетов, которые могут использоваться в соответствующей области техники. В следующих примерах была использована система MiCAM02 (Brainvision Inc.).

[0035] Вышеприведенные результаты, в своей совокупности, показали, что не только в экспериментальной системе, которая не включает применение мембранного носителя, такого как клетки или липидные бислойные липосомы, но также в традиционной экспериментальной системе, в которой используется мембранный носитель, такой как клетки или липидные бислойные липосомы, витамин E способен увеличить чувствительность потенциалочувствительных флуорохромов, тогда как и витамин E, и холестерин способны увеличить интенсивность флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов в зависимости от изменения потенциала или ионной силы. Таким образом, было показано, что настоящим изобретением может быть обеспечен новый способ измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, который включает добавление к потенциалочувствительному флуорохрому ионизирующегося соединения для вызова изменения потенциала или ионной силы, а также добавление витамина E и/или холестерина для увеличения изменения потенциала или ионной силы согласно потенциалочувствительному флуорохрому.

[0036] Настоящее изобретение описывается подробнее посредством ссылки на следующие примеры. Однако следует отметить, что эти примеры представляют собой иллюстрации настоящего изобретения и, как предполагается, никоим образом не ограничивают его.

Создание способа измерения интенсивности флуоресценции и потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции, используя потенциалочувствительные флуорохромы, образующие твердую фазу на поверхности подложки

[0037] В примере 1 описаны способ образования твердой фазы потенциалочувствительных флуорохромов на поверхностях подложек, таких как прозрачная пластмасса или стекло, и способ измерения интенсивностей флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов и потенциалозависимых изменений интенсивности их флуоресценции.

[0038] Потенциалочувствительный флуорохром (Di8-ANEPPS или Di4-ANEPPS, оба имеющиеся в продаже от Invitrogen), смешивали в количестве, равном 50 мкМ, в среде MEM-BASE (Sigma-Aldrich Corporation, St. Louis, Missouri, США), содержащей фетальную телячью сыворотку (SAFC Biosciences, Lenexa, Kansas, США) в конечной концентрации, равной 10%, и смесь пропускали через 0,22 мкм шприцевой фильтр (Millipore, Massachusetts, США) для приготовления раствора потенциалочувствительного флуорохрома.

[0039] Равную 1 мл часть этого флуорохрома добавляли в каждую 3,5-см пластмассовую чашку для культивирования (BD, New Jersey, США) и 3,5-см чашку со стеклянным дном (IWAKI, Asahi Glass Co., Ltd., Tokyo, Япония), с последующей обработкой поверхности при 20°С в течение 15 минут. Подвергнутые обработке поверхности промывали по меньшей мере три раза тем же раствором, что и описанный выше раствор, за исключением того, что он не содержал какого-либо потенциалочувствительного флуорохрома, и что он был нагрет до 37°С, удаляя тем самым любую часть потенциалочувствительного флуорохрома, которая не образовала твердую фазу.

[0040] Среду заменяли содержащей 10% фетальной телячьей сыворотки средой MEM-BASE, дополненной 50 мкМ Mn-TBAP (Calbiochem, Merck KGaA, Darmstadt, Германия) и 992 мкМ Trolox (Wako Pure Chemical Industries, Ltd., Osaka, Япония), и флуоресцентные сигналы фиксировали, используя флуоресцентную микроскопическую систему IX71 (Olympus Corporation, Tokyo, Япония) и ртутную лампу (Olympus Corporation, Tokyo, Япония) или источник света LED (Olympus Corporation, Tokyo, Япония), с последующей обработкой изображений и численными расчетами, используя систему MiCAM02 (Brainvision Inc., Tokyo, Япония).

[0041] Для обеспечения изменений потенциала в растворе потенциалочувствительного флуорохрома к раствору флуорохрома добавляли раствор хлорида калия с получением конечных концентраций, равных 0, 5, 10, 15 и 20 мМ. После выдерживания в течение 1 мин после добавления хлорида калия измеряли интенсивность флуоресценции от поверхности каждой чашки (в которой присутствовал потенциалочувствительный флуорохром). Интенсивность флуоресценции для каждой концентрации флуорохрома замеряли в трех различных точках на чашке и определяли среднеквадратическое отклонение от среднего значения замеренных интенсивностей. Данные наносили на графики с построением графиков для интенсивности флуоресценции и изменения интенсивности флуоресценции (Фиг.1).

[0042] Фиг.1(a) относится к случаю, когда Di8-ANEPPS образовывал твердую фазу на поверхности пластмассовой чашки, (b) — к случаю, когда Di4-ANEPPS образовывал твердую фазу на поверхности пластмассовой чашки, а (c) — к случаю, когда Di8-ANEPPS образовывал твердую фазу на поверхности стеклянной чашки. На основе этих результатов стало ясно, что интенсивность флуоресценции увеличивается пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия) независимо от того, из какого материала (стекла или пластмассы) была изготовлена подложка, или типа используемого потенциалочувствительного флуорохрома.

[0043] Кроме того, для определения диапазона концентраций, в котором потенциалочувствительный флуорохром эффективно работает, на поверхность 3,5-см пластмассовой чашки для культивирования наносили 10 мкМ или 100 мкМ Di8-ANEPPS или RH237 (оба имеются в продаже от Invitrogen) и осуществляли обработку, как описано выше, для приготовления раствора потенциалочувствительного флуорохрома; после этого к этому раствору флуорохрома добавляли раствор хлорида калия с получением конечных концентраций, равных 0, 5, 10, 15 и 20 мМ. Данные, полученные в результате выполнения последующих обработок, измерений и обработок данных, описанных выше, наносили на графики (Фиг. 2).

[0044] На Фиг.2(a) представлены данные для случая, когда Di8-ANEPPS использовали в количествах, равных 10 мкМ и 100 мкМ, а на фиг 2(b) — данные для случая, когда RH237 использовали в количествах, равных 10 мкМ и 100 мкМ. На основе этих результатов стало ясно, что изменения интенсивности флуоресценции возникают пропорционально концентрации добавленного ионизирующегося соединения (хлорида калия).

Скрининг на усилители интенсивности флуоресценции и процента потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции (чувствительности), используя потенциалочувствительный флуорохром, образующий твердую фазу на поверхности подложки

[0045] В этом примере описаны способ скрининга для обнаружения веществ, которые могли бы увеличить интенсивность флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома, отмеченного в примере 1, и процента потенциалозависимого изменения интенсивности его флуоресценции (т.е. его чувствительности), а также к способам идентификации веществ, имеющих соответствующие действия.

[0046] В соответствии с процедурой, описанной в примере 1, в качестве раствора потенциалочувствительного флуорохрома готовили раствор Di8-ANEPPS (100 мкМ), в который добавляли 75 мкМ витамин E (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) или 75 мкМ холестерин (Wako Pure Chemical Industries, Ltd.), или их комбинацию. Потенциалозависимое количествественное изменение интенсивности флуоресценции и потенциалозависимую интенсивность флуоресценции анализировали, как описано в примере 1, используя способ добавления раствора хлорида калия с получением конечных концентраций, равных 0, 5, 10, 15 и 20 мМ; результаты представлены графически на Фиг.3 для группы с добавлением витамина E («VE 18,75 мкМ»), группы с добавлением холестерина («Cho 18,75 мкМ»), группы с добавлением витамина E + холестерина («двойной») и контрольной группы («di-8»).

[0047] На Фиг.3(a) представлены определенные значения процента изменения интенсивности флуоресценции, а на Фиг.3(b) представлены измеренные значения интенсивности флуоресценции; на каждом графике ◆ относится к контрольной группе (только Di8-ANEPPS был добавлен), ■ — к группе с добавлением витамина E, ▲ — к группе с добавлением холестерина, и ● — к группе с добавлением витамина E + холестерина.

[0048] Процент изменения интенсивности флуоресценции, графически нанесенный на Фиг. 3(a), в сравнении со случаем, когда хлорид калия не был добавлен, ясно показывает, что витамин E обладает сенсибилизирующим действием в отношении потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. усиливающим чувствительность его флуоресценции).

[0049] Увеличение интенсивности флуоресценции, сравнение которого при различных концентрациях KCl представлено на Фиг. 3(b), показало, что и витамин E, и холестерин выполняют функцию увеличения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома. Кроме того, комбинированное применение витамина E и холестерина не только имело аддитивный эффект на увеличение интенсивности флуоресценции, но также проявило принесенное витамином E сенсибилизирующее действие в отношении потенциалочувствительного флуорохрома (т.е. усиливающее чувствительность его флуоресценции или увеличивающее процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции). Эти результаты демонстрируют громадное преимущество раскрытого здесь способа в качестве способа скрининга на вещества, которые могли бы увеличить интенсивности флуоресценции потенциалочувствительных флуорохромов, и/или веществ, которые могли бы увеличить процент потенциалозависимого изменения интенсивности флуоресценции.

[0050] Кроме того, для определения диапазона эффективных на практике концентраций холестерина и витамина E, к 100 мкМ Di8-ANEPPS в растворе добавляли 5 мкМ, 18,7 мкМ или 500 мкМ витамина E или 18,8 мкМ или 238 мкМ холестерина; каждый из растворов наносили на поверхность 3,5-см пластмассовой чашки для культивирования, и затем к растворам флуорохрома добавляли раствор KCl с получением конечных концентраций, равных 0, 10, 20, 30, 40 и 50 мМ; результаты последующих обработок и обработки данных нанесены на графики (Фиг. 4).

[0051] Как оказалось, холестерин увеличивал интенсивность флуоресценции дозозависимым образом, тогда как витамин E, не являющийся зависимым от дозы по показателю либо интенсивности флуоресценции, либо процента изменения интенсивности флуоресценции, увеличивал интенсивность флуоресценции приблизительно в 1,5 раза, а процент изменения интенсивности флуоресценции приблизительно в 3 раза при условии нахождения его концентрации в пределах диапазона от 18,7 мкМ до 500 мкМ. Также стало ясно, что витамин E выполнял функцию увеличения процента изменения интенсивности флуоресценции, даже когда его концентрация составляла всего 5 мкМ.

Измерения потенциалов действий кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток человека и iPS клеток человека

[0052] В этом примере были исследованы действия витамина E и холестерина на получение информации о потенциале действия от кардиомиоцитов; кардиомиоциты были получены в результате подвергания дифференцировке ES клеток человека и iPS клеток человека и подвергнуты культивированию с ферментативным разъединением.

[0053] Эмбриональные стволовые клетки человека (ES клетки) были получены из Stem Cell Research Center, Institute for Frontier Medical Sciences, Kyoto University (Центра эмбриональных стволовых клеток, финансируемого Национальной программой по биоресурсам). Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки человека (iPS клетки) были получены из Center for iPS Cell Research and Application, Institute for Integrated Cell-Material Sciences, Kyoto University.

[0054] Для этих стволовых клеток человека создавали возможность оставаться недифференцированными посредством культивирования при поддержке мышиных эмбриональных фибробластов (MEF), которые были превращены в неактивные в отношении пролиферации в результате обработки митомицином C. Для приготовления клеток MEF плод мыши ICR в день 14 беременности (CLEA Japan, Inc.) обезглавливали и подвергали эвисцерации, и впоследствии разделяли на отдельные клетки способом, описанным в WO 2006/022377.

[0055] Культуральной средой была F12/DMEM (1:1) (Sigma-Aldrich Corporation; № продукта D6421), которая была дополнена 20% KO-SERUM (GIBCO, Life Technologies Foundation, Maryland, США), 1,6 мМ L-глютамином, 0,1 мМ заменимыми аминокислотами (MEM), 0,1 мМ β-меркаптоэтанолом (2ME; Sigma-Aldrich Corporation), 100 МЕ/мл пенициллина, 100 мкг/мл стрептомицина сульфата и 10 нг/мл рекомбинантного основного фактора роста фибробластов человека (bFGF; PeproTech Inc., New Jersey, США). Для субкультивирования колонии эмбриональных стволовых клеток разъединяли при 37°С посредством 10-минутной обработки 0,1% коллагеназы типа III (Worthington Biochemical Corporation, New Jersey, США).

[0056] Впоследствии, для отделения MEF от эмбриональных стволовых клеток, клеточные массы (эмбриоидные тельца, EB) собирали на сетке с размером пор, равным 40 мкм. Они представляли собой очищенные массы эмбриональных стволовых клеток. Для дифференцировки 50-1000 эмбриональных стволовых клеток в EB подвергали культивированию в виде эмбриоидных телец на бактериальной чашке для неадгезионного культивирования (AGC TECHNO GLASS CO., LTD., Chiba, Япония; стерилизованной чашке Петри) в течение всего 15-30 дней до их дифференцировки в эмбриоидные тельца, содержащие кардиомиоциты.

[0057] Кардиомиоциты разделяли способом, описанным в WO 2006/022377. Конкретно, эмбриоидное тельце подвергали обработке коллагеназой и трипсином для создания отдельных единичных клеток. Эти клетки суспендировали в содержащей 10% сыворотке αMEM (Sigma-Aldrich Corporation) и засевали в 3,5-см пластмассовую чашку для культивирования (BD) и 3,5-см чашку со стеклянным дном (IWAKI, Asahi Glass Co., Ltd.), при этом поверхность каждой чашки была покрыта 0,001% фибронектином (Sigma-Aldrich Corporation) при 37°С в течение часа. Прилипающие кардиомиоциты были автономно ритмически сокращающимися.

[0058] Измерения потенциала действия на этих кардиомиоцитах осуществляли в отсутствие витамина E и холестерина. В других экспериментах культивируемые клетки подвергали обработке потенциалочувствительным флуорохромом и 18,75 мкМ витамина E и/или 18,75 мкМ холестерина, а затем измеряли преходящее изменение интенсивности флуоресценции. Эта обработка давала возможность получать информацию о потенциалах действий от единичных клеток, а также части единичной клетки (Фиг.5).

[0059] На Фиг.5(a) представлен результат измерений на изолированных кардиомиоцитах, происходящих из ES клеток человека, в отсутствие витамина E и холестерина; на Фиг.5(b) представлен потенциал действия, полученный от изолированного кардиомиоцита, происходящего из ES клетки; и на Фиг.5(c) представлен потенциал действия, полученный от изолированного кардиомиоцита, происходящего из iPS клетки человека.

[0060] Как оказалось, колебания потенциала действия, которые невозможно было выявить от единичных кардиомиоцитов, происходящих из ES клеток, в отсутствие витамина E или холестерина, стали заметными после добавления этих веществ. Также стало ясно, что витамин E и холестерин, которые выполняли функцию сенсибилизации или усиления потенциалочувствительного флуорохрома в отсутствие клеток в качестве мембранного носителя, могут также проявлять такое же действие даже при использовании клеток в качестве мембранного носителя.

Claims ( 10 )

1. Способ измерения изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы, который включает добавление к потенциалочувствительному флуорохрому ионизирующегося соединения для вызова изменения потенциала или ионной силы, а также добавление витамина Е и/или холестерина для увеличения изменения потенциала или ионной силы по потенциалочувствительному флуорохрому.

2. Способ по п.1, при этом используют 500 мкМ — 5 мкМ витамина Е либо отдельно, либо в комбинации с 500 мкМ — 5 мкМ холестерина.

3. Способ по п.1 или 2, при этом потенциалочувствительный флуорохром выбирают из группы, состоящей из потенциалочувствительных флуорохромов на основе гемицианинов с конденсированным ядром, включающих ANNINE, потенциалочувствительных флуорохромов на основе биарилгемицианинов, включающих BNBIQ, и потенциалочувствительных флуорохромов на основе стирилгемицианинов, включающих ANEPPS, ANRPEQ и RH.

4. Способ по п.3, при этом потенциалочувствительный флуорохром выбирают из группы, состоящей из di-8-ANEPPS, di-4-ANEPPS, RH-237, RH-1691, di-5-ASP, RH-160, RH-421, RH-795, di-4-ANEPPDHQ, ANNINE-5 и ANNINE-6.

5. Способ по п.1 или 2, в котором ионизирующееся соединение выбирают из группы, состоящей из хлорида калия, хлорида кальция и хлорида натрия.

6. Способ измерения потенциала действия культивируемых кардиомиоцитов, который включает приведение потенциалочувствительного флуорохрома в контакт с кардиомиоцитами, культивируемыми в культуральной среде, добавление в культуральную среду витамина Е и/или холестерина и измерение изменений интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуорохрома в зависимости от изменения потенциала или ионной силы.

7. Способ по п.6, при этом культивируемыми кардиомиоцитами являются эмбриональные культивируемые кардиомиоциты, происходящие из эмбриональных стволовых клеток кардиомиоциты, единичный кардиомиоцит, происходящий из эмбриональной стволовой клетки, кардиомиоциты, происходящие из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток (iPS клеток), или единичный кардиомиоцит, происходящий из индуцированной плюрипотентной стволовой клетки (iPS клетки).

8. Способ по п.6 или 7, при этом используют 500 мкМ — 5 мкМ витамина Е либо отдельно, либо в комбинации с 500 мкМ — 5 мкМ холестерина.

9. Способ по п.6 или 7, при этом потенциалочувствительный флуорохром выбирают из группы, состоящей из потенциалочувствительных флуорохромов на основе гемицианинов с конденсированным ядром, включающих ANNINE, потенциалочувствительных флуорохромов на основе биарилгемицианинов, включающих BNBIQ, и потенциалочувствительных флуорохромов на основе стирилгемицианинов, включающих ANEPPS, ANRPEQ и RH.

10. Способ по п.9, при этом потенциалочувствительный флуорохром выбирают из группы, состоящей из di-8-ANEPPS, di-4-ANEPPS, RH-237, RH-1691, di-5-ASP, RH-160, RH-421, RH-795, di-4-ANEPPDHQ, ANNINE-5 и ANNINE-6.

RU2012122181/04A 2009-10-30 2010-10-29 Способ измерения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуоресцентного красителя RU2536045C2 ( ru )

Applications Claiming Priority (3)

Application Number	Priority Date	Filing Date	Title
JP2009-251123	2009-10-30
JP2009251123	2009-10-30
PCT/JP2010/069763 WO2011052801A1 ( ja )	2009-10-30	2010-10-29	電位感受性蛍光色素の蛍光強度測定方法

Publications (2)

Publication Number	Publication Date
RU2012122181A RU2012122181A ( ru )	2013-12-10
RU2536045C2 true RU2536045C2 ( ru )	2014-12-20

Family

ID=43922222

Family Applications (1)

Application Number	Title	Priority Date	Filing Date
RU2012122181/04A RU2536045C2 ( ru )	2009-10-30	2010-10-29	Способ измерения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуоресцентного красителя

Country Status (11)

Country	Link
US ( 1 )	US20120214193A1 ( ru )
EP ( 1 )	EP2495550A1 ( ru )
JP ( 1 )	JP5555248B2 ( ru )
KR ( 1 )	KR20120085284A ( ru )
CN ( 1 )	CN102612644A ( ru )
AU ( 1 )	AU2010312410A1 ( ru )
BR ( 1 )	BR112012010233A2 ( ru )
CA ( 1 )	CA2778897A1 ( ru )
IL ( 1 )	IL219401A0 ( ru )
RU ( 1 )	RU2536045C2 ( ru )
WO ( 1 )	WO2011052801A1 ( ru )

Families Citing this family (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party

Publication number	Priority date	Publication date	Assignee	Title
CN104089999A ( zh ) *	2014-06-25	2014-10-08	复旦大学	基于碳量子点-纳米线阵列的心肌细胞信号分子传感器及其制备方法
WO2016010165A1 ( ja )	2014-07-16	2016-01-21	学校法人慶應義塾	新規未分化幹細胞除去および心筋純化精製培地
US10060853B2 ( en ) *	2016-07-28	2018-08-28	Eastman Kodak Company	Method for determining a characteristics difference between fluids
US10054544B2 ( en ) *	2016-07-28	2018-08-21	Eastman Kodak Company	Method for characterizing a liquid
US10113978B2 ( en ) *	2016-07-28	2018-10-30	Eastman Kodak Company	Method for measuring solid-liquid interfacial electric field
RU2735247C1 ( ru )	2016-10-17	2020-10-29	Кейо Юниверсити	Удаляющее недифференцированные стволовые клетки средство и способ удаления недифференцированных стволовых клеток
CN107202779A ( zh ) *	2017-04-27	2017-09-26	浙江科技学院	一种微囊泡诱导细胞膜电位变化的无损检测方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party

Publication number	Priority date	Publication date	Assignee	Title
JP2003515163A ( ja ) *	1999-11-24	2003-04-22	アイオワステイトユニヴァーシティリサーチファウンデーションインコーポレイテッド	光センサ及びアレイ含有薄膜電界発光素子
US20050064523A1 ( en ) *	2003-08-19	2005-03-24	Min Wu	Method of screening endothelial cells for angiogenic capability
RU2251111C2 ( ru ) *	1999-07-30	2005-04-27	Байоэргономикс, Инк.	Способы одновременного выявления обоих компонентов связывающейся пары
UA83147C2 ( ru ) *	2007-03-01	2008-06-10	Тернопольский Государственный Медицинский Университет Имени И.Я. Горбачевского	Способ флуоресцентной микроскопии

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party

Publication number	Priority date	Publication date	Assignee	Title
AT384677B ( de ) *	1985-04-16	1987-12-28	Avl Verbrennungskraft Messtech	Sensor zur bestimmung von elektrolytkonzentrationen
JPH05332937A ( ja ) *	1992-05-27	1993-12-17	Olympus Optical Co Ltd	オプティカルイオンセンサー
US6287758B1 ( en ) *	2000-03-23	2001-09-11	Axiom Biotechnologies, Inc.	Methods of registering trans-membrane electric potentials
EP1336102A2 ( en ) *	2000-11-22	2003-08-20	Allergan, Inc.	A high-throughput screen for identifying channel blockers that selectively distinguish transient from persistent sodium channels
JP2003254973A ( ja ) *	2002-03-05	2003-09-10	Asahi Glass Co Ltd	発光増感剤
RU2371478C2 ( ru )	2004-08-27	2009-10-27	Асубио Фарма Ко., Лтд.	Способ отбора кардиомиоцитов с использованием внутриклеточных митохондрий в качестве индикатора
CN101787218B ( zh ) *	2010-01-15	2014-04-02	大连理工大学	一类共轭链上β-位氮取代五甲川菁类荧光染料

2010

2010-10-29 RU RU2012122181/04A patent/RU2536045C2/ru not_active IP Right Cessation
2010-10-29 US US13/505,272 patent/US20120214193A1/en not_active Abandoned
2010-10-29 KR KR1020127012275A patent/KR20120085284A/ko not_active Application Discontinuation
2010-10-29 AU AU2010312410A patent/AU2010312410A1/en not_active Abandoned
2010-10-29 EP EP10826931A patent/EP2495550A1/en not_active Withdrawn
2010-10-29 BR BR112012010233A patent/BR112012010233A2/pt not_active IP Right Cessation
2010-10-29 CN CN2010800495733A patent/CN102612644A/zh active Pending
2010-10-29 JP JP2011538529A patent/JP5555248B2/ja not_active Expired — Fee Related
2010-10-29 CA CA2778897A patent/CA2778897A1/en not_active Abandoned
2010-10-29 WO PCT/JP2010/069763 patent/WO2011052801A1/ja active Application Filing

2012-04-24 IL IL219401A patent/IL219401A0/en unknown

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party

Publication number	Priority date	Publication date	Assignee	Title
RU2251111C2 ( ru ) *	1999-07-30	2005-04-27	Байоэргономикс, Инк.	Способы одновременного выявления обоих компонентов связывающейся пары
JP2003515163A ( ja ) *	1999-11-24	2003-04-22	アイオワステイトユニヴァーシティリサーチファウンデーションインコーポレイテッド	光センサ及びアレイ含有薄膜電界発光素子
US20050064523A1 ( en ) *	2003-08-19	2005-03-24	Min Wu	Method of screening endothelial cells for angiogenic capability
UA83147C2 ( ru ) *	2007-03-01	2008-06-10	Тернопольский Государственный Медицинский Университет Имени И.Я. Горбачевского	Способ флуоресцентной микроскопии

Also Published As

Publication number	Publication date
JP5555248B2 ( ja )	2014-07-23
RU2012122181A ( ru )	2013-12-10
KR20120085284A ( ko )	2012-07-31
CA2778897A1 ( en )	2011-05-05
BR112012010233A2 ( pt )	2016-03-29
CN102612644A ( zh )	2012-07-25
AU2010312410A1 ( en )	2012-05-31
IL219401A0 ( en )	2012-06-28
WO2011052801A1 ( ja )	2011-05-05
US20120214193A1 ( en )	2012-08-23
JPWO2011052801A1 ( ja )	2013-03-21
EP2495550A1 ( en )	2012-09-05

Publication	Publication Date	Title
RU2536045C2 ( ru )	2014-12-20	Способ измерения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуоресцентного красителя
Liu et al.	2019	Highly purified human extracellular vesicles produced by stem cells alleviate aging cellular phenotypes of senescent human cells
Lippmann et al.	2014	A retinoic acid-enhanced, multicellular human blood-brain barrier model derived from stem cell sources
Lin et al.	2011	Chemical analysis of single cells
Bisson et al.	2013	Irradiated human dermal fibroblasts are as efficient as mouse fibroblasts as a feeder layer to improve human epidermal cell culture lifespan
Goto et al.	2019	Standardization of human calcific aortic valve disease in vitro modeling reveals passage-dependent calcification
Zareba-Koziol et al.	2019	Stress-induced Changes in the S-palmitoylation and S-nitrosylation of Synaptic Proteins*[S]
Yang et al.	2011	Real-time electrical impedance-based measurement to distinguish oral cancer cells and non-cancer oral epithelial cells
HD iPSC Consortium http://orcid. org/0000-0001-6156-5046 Kedaigle Amanda J Fraenkel Ernest Atwal Ranjit S Wu Min Gusella James F MacDonald Marcy E Kaye Julia A Finkbeiner Steven Mattis Virginia B Tom Colton M Svendsen Clive King Alvin R Chen Yumay Stocksdale Jennifer T Lim Ryan G Casale Malcolm Wang Ping H Thompson Leslie M Akimov Sergey S Ratovitski Tamara Arbez Nicolas Ross Christopher A caross@ jhu. edu	2020	Bioenergetic deficits in Huntington’s disease iPSC-derived neural cells and rescue with glycolytic metabolites
US20140154735A1 ( en )	2014-06-05	Tumour cell and tissue culture
Qi et al.	2010	In vitro differentiation of bone marrow stromal cells into neurons and glial cells and differential protein expression in a two-compartment bone marrow stromal cell/neuron co-culture system
Cifuentes et al.	2021	Heparin/collagen surface coatings modulate the growth, secretome, and morphology of human mesenchymal stromal cell response to interferon‐gamma
Ali et al.	2020	Generation and proteome profiling of PBMC-originated, iPSC-derived lentoid bodies
Beller et al.	2021	Spatial stable isotopic labeling by amino acids in cell culture: pulse-chase labeling of three-dimensional multicellular spheroids for global proteome analysis
US9835616B2 ( en )	2017-12-05	In vitro method for assessing cytokine storm responses
Shen et al.	2017	High mobility group box 1 induces calcification of aortic valve interstitial cells via toll-like receptor 4
Mazzucchelli et al.	2015	Expression and function of toll-like receptors in human circulating endothelial colony forming cells
Wang et al.	2022	Extracellular Vesicles from Human Cardiac Fibroblasts Modulate Calcium Cycling in Human Stem Cell-Derived Cardiomyocytes
Røst et al.	2020	PCNA has specific functions in regulation of metabolism in haematological cells
Kato et al.	2015	Hypoxia induces an undifferentiated phenotype of oral keratinocytes in vitro
Lork et al.	2022	Chemical Imaging and Analysis of Single Nerve Cells by Secondary Ion Mass Spectrometry Imaging and Cellular Electrochemistry
Guo et al.	2022	Immunofluorescence staining of phosphoinositides in primary mouse hippocampal neurons in dissociated culture
Torrino et al.	2020	Biophysical forces rewire cell metabolism to guide microtubule-dependent cell mechanics
Harmati	2019	Small extracellular vesicles convey the stress response of tumour cells
Andronico et al.	2024	High-throughput analysis of membrane fluidity unveils a hidden dimension in immune cell states

Legal Events

Effective date: 20151030

В чем измеряется интенсивность флуоресценции

21.2.4. Влияние различных факторов на интенсивность флуоресценции растворов

21.2.5. Измерение аналитического сигнала

В чем измеряется интенсивность флуоресценции

1.6.2. Измерение спектров отражения, пропускания, прозрачности, люминесценции и возбуждения излучения

RU2536045C2 — Способ измерения интенсивности флуоресценции потенциалочувствительного флуоресцентного красителя — Google Patents

Links

Images

Classifications

Abstract

Description

Claims ( 10 )

Applications Claiming Priority (3)

Publications (2)

Family

ID=43922222

Family Applications (1)

Country Status (11)

Families Citing this family (7)

Citations (4)

Family Cites Families (7)

Patent Citations (4)

Also Published As

Similar Documents

Legal Events

Добавить комментарий Отменить ответ