Электронный микроскоп что можно увидеть

Применение электронной микроскопии в органической химии

Институт органической химии (ИОХ РАН) в настоящее время является единственным институтом в нашей стране, в котором активно развивается электронная микроскопия в приложении к органическим молекулам. Факт этот необычный, поскольку электронные микроскопы традиционно редко используются химиками-органиками. Давайте посмотрим, зачем же электронная микроскопия может понадобиться в классических исследованиях по органической химии. Представляем интервью акад. М.П. Егорова и акад. В.П. Ананикова по развитию электронной микроскопии в ИОХ РАН.

— Михаил Петрович, скажите, зачем, действительно, нужны электронные микроскопы в Институте органической химии?

— В настоящее время электронная микроскопия, если мы говорим о современном мировом уровне, становится перспективным инструментом именно в исследованиях органического профиля. Хорошо известно, что электронные микроскопы активно используются в катализе, и там это один из основных методов для характеризации гетерогенных катализаторов. Причем, не только процессов их создания, но и процессов функционирования катализаторов. Поскольку каталитические системы активно используются в органическом синтезе, то в выполнении исследований в этой области химикам-органикам без электронной микроскопии не обойтись.

Вторая сфера, где активно применяется электронная микроскопия, связана с материаловедением, с получением органических материалов различной природы: полимерных материалов, комплексных материалов, композитных материалов. В таких проектах необходимо исследовать морфологию, определять микроструктуру и делать их элементный анализ.

Третья область, пожалуй, самая необычная и наиболее активно развивающаяся, – это исследования наноразмерной структуры органических веществ, в том числе, классических органических соединений. До недавнего времени это было невозможно, но в настоящее время такая возможность имеется: с помощью современных электронных микроскопов такое исследование можно выполнять. То есть можно сказать, что электронная микроскопия может быть задействована практически на всех этапах исследования в области органической химии от характеризации индивидуальных органических веществ до изучения каталитических реакций и создания новых материалов.

— Если электронная микроскопия настолько важна для химиков-органиков, почему же они ею не пользовались раньше и мало пользуются сейчас?

— Все дело в том, что электронные микроскопы первых поколений работали только при высоких ускоряющих напряжениях – это были десятки, либо даже сотни киловольт. При таких ускоряющих напряжениях многие органические соединения деформировались или просто сгорали внутри камеры электронного микроскопа еще до того, как можно было выполнить это исследование. Ситуация кардинально поменялась с появлением современных электронных микроскопов, которые работают при меньших ускоряющих напряжениях – это сотни, а в определенных случаях даже десятки вольт, и при очень малых значениях силы тока электронного пучка. Такое воздействие не деформирует образец, и сейчас мы можем исследовать органические соединения с помощью электронного микроскопа и получать превосходные изображения. Более того, активно исследуются биологические, биохимические объекты, причем с достаточно упрощенной процедурой пробоподготовки.

— Какой опыт у ИОХа в использовании электронной микроскопии и какие достижения на сегодняшний день?

— У ИОХа накоплен положительный опыт в использовании электронной микроскопии: первым микроскопом был сканирующий электронный микроскоп Hitachi SU8000. Он был установлен в Институте органической химии в 2011 г. Инициатором этой покупки был руководитель лаборатории нашего института — Валентин Анаников. На этом микроскопе в настоящее время зарегистрированы тысячи изображений и он активно применяется во всех областях деятельности Института, о которых я говорил выше. Этот опыт оказался настолько позитивным, что через несколько лет, в 2016 году был приобретен просвечивающий электронный микроскоп Hitachi HT7700, который в настоящее время активно используется. И наше последнее приобретение было сделано в прошлом году: был установлен микроскоп нового поколения Hitachi Regulus8230 и, как раз этот прибор наибольшим образом оптимизирован для работ с минимальным ускоряющим напряжением и не деформирует образцы.

Все электронные микроскопы сейчас функционируют и на них работают сотрудники лаборатории В. Ананикова, которые выполняют как собственные научные исследования, так и обеспечивают электронной микроскопией сотрудников нашего Института, оказывая помощь в выполнении совместных проектов.

У нас накоплен уже очень большой опыт исследований по применению электронной микроскопии в области органической химии, уже опубликованы сотни статей нашими сотрудниками, где задействованы исследования с применением как сканирующей, так и просвечивающей электронной микроскопии. Некоторые работы опубликованы в таких журналах как N ature Communications , JACS Au , Angewandte Chemie и многих других. Было открыто новое научное направление, которое получило всемирное признание — электронная микроскопия в жидкостях. Примечательно, что обзор этого направления для журнала Nature Reviews Chemistry пригласили написать сотрудников ИОХа. Это был первый обзор из нашей страны, опубликованный в данном престижном издании.

— Готов ли Институт поделиться своим опытом в этой области?

— Конечно ИОХ открыт для сотрудничества: мы готовы проводить семинары на эту тему, мы готовы обучать наших коллег работе на электронном микроскопе, мы регулярно проводим тренинги в области электронной микроскопии для студентов, аспирантов и сотрудников других научно-образовательных организаций нашей страны, все желающие могут к нам обратиться. Мы ведем активные совместные исследования, у нас много проектов с научно-образовательными организациями. Если кто-то заинтересован, если кто-то нуждается в исследованиях в области электронной микроскопии, мы можем, соответственно, такие работы проводить.

— Скажите, Валентин Павлович, в своем ответе Михаил Петрович упоминал, что электронные микроскопы были впервые приобретены по запросу Вашей лаборатории и, соответственно, сейчас эксплуатируются вашими сотрудниками. Насколько сложен этот анализ? Насколько удобно им пользоваться? Сколько времени это занимает?

— Действительно, мы установили первый электронный микроскоп в ИОХе более 10 лет назад. Нам показалось, что он крайне необходим и будет очень перспективен в исследовании органических соединений. Тогда этим мало кто занимался, потому что действительно бытовало такое мнение, что электронная микроскопия разрушает органические вещества и провести качественное исследование не получится. Однако оказалось, что уже приборы того поколения прекрасно подходят для исследования органических объектов, и мы смогли зарегистрировать качественные микрофотографии. Хочу сказать, что анализ на современном электронном микроскопе является процедурой достаточно быстрой: для простого объекта изображение на электронном микроскопе можно получить примерно в течение 15-20 минут. Это будет изображение высокого качества, которое напрямую можно использовать для анализа и последующей публикации. Примеры таких изображений, полученных студентами и аспирантами можно посмотреть в Телеграм-канале нашей лаборатории.

Конечно есть очень сложные объекты, где нужно потратить час, два, а может быть, даже несколько дней для получения качественного изображения на электронном микроскопе, но в настоящее время эта задача решаемая для самого широкого круга объектов.

— Разрабатывает ли Институт органической химии какие-либо новые методики, либо для этого метода достаточно только стандартных методик?

— Мы активно разрабатываем новые методики в области электронной микроскопии, в частности, нами были разработаны методики для изучения жидкостей и для исследования реакций в растворах. Поскольку в электронной микроскопии измерение проводится в глубоком вакууме, обычные органические растворители при таких давлениях мгновенно испаряются даже при комнатной температуре. Поэтому напрямую при помощи стандартных методов изучать растворы нельзя.

А поскольку подавляющее большинство реакций органического синтеза проходят в растворах, химику-органику в первую очередь интересны, конечно, именно растворы. Соответственно, нами была разработана специальная методология для исследования реакций в жидкой фазе: как реакций органического синтеза, так и каталитических процессов. Это наша собственная разработка, которую нам действительно удалось внедрить в практику. Сейчас мы проводим такие исследования для своих проектов и с удовольствием выполняем совместные работы для всех, кто в этом заинтересован.

— Скажите, чего можно ожидать от электронной микроскопии в ближайшем будущем?

— Электронная микроскопия активно развивается, как с точки зрения разработки нового оборудования, так и создания новых научных подходов. В настоящее время из такого малоиспользуемого для химиков-органиков инструмента, она превращается в ведущий исследовательский метод. В данный момент во многих сферах органической химии практически невозможно себе представить актуальную исследовательскую работу, которая была бы выполнена без использования микроскопии. Планы на ближайшее будущее – это изучение динамических систем. Не просто статические картинки, не просто фотографии объектов в микромире, а серия фотографий, даже видеоролики, которые позволяют зафиксировать процессы, происходящие на микро- и наноразмерном уровне. На оборудовании, которое есть в нашем Институте, нам удалось снять видеоролики реакций с участием наночастиц: видно, как наночастицы формируются, трансформируются, вступают в реакцию. Нам впервые удалось зарегистрировать видеоролик растворения наночастицы в органическом растворителе. Будущее – именно за исследованиями динамических процессов, ведь каждый химик мечтает своими глазами увидеть, как реагируют молекулы. Именно увидеть: не пользоваться косвенными данными, не интерпретировать спектроскопические наблюдения, а самому посмотреть, как молекулы сближаются, взаимодействую и вступают в химические реакции. Я думаю, что в ближайшем будущем эта мечта будет реализована, и в этом деле важнейшая роль отводится именно микроскопии.

Материал подготовила: Мария Корганова

Электронная микроскопия

Электронная микроскопия – один из методов исследования микроструктуры твердых тел, их электрических и магнитных полей, локального состава с применением совокупности электронно-зондовых методов. Данная технология была запатентована в 1931 году Р. Руденбергом, который создал первый в мире электронный микроскоп. Сегодня – это один из наиболее эффективных и передовых методов исследования, который широко используется на предприятиях, в научных, учебных лабораториях.

Метод электронной микроскопии

Данная технология стала основой в создании электронных микроскопов – приборов, в которых для построения изображения используется не световой луч, а поток электронов в вакуумной среде. Роль оптических линз, которые используются в обычных микроскопах, здесь отведена электронному полю. Именно оно и фокусирует электроны. Электромагнитное поле формируется электромагнитными катушками.

Изображение передается на флюоресцирующий экран, где его можно сфотографировать и рассмотреть детально. К изучаемым объектам предъявляется ряд требований:

Необходима предварительная фиксация и обработка. Объекты в процессе работы будут находиться в глубоком вакууме.
Маленькая толщина. Поток электронов будет сильно поглощаться объектом. И большую толщину он не «пробьет». В качестве объектов используются срезы, толщиной от 20 до 50 нм. Для удобства работы их размещают на тонкие прозрачные пленки.
Равномерность слоя. Перед началом исследования проводится механическая обработка. Она способна обеспечить постоянную толщину образца.

Разрешающая способность у электронных микроскопов значительно выше, чем у оптических. Величина 0,15 нм (15 А) позволяет получать увеличение в миллионы раз, что идеально подходит для изучения микроскопических объектов.

Основные особенности

Суть метода электронной микроскопии в том, что через исследуемый образец подается электронный пучок разной энергии. Под воздействием электромагнитного поля он фокусируется на поверхности в виде пятна, в диаметре не превышающего 5 нм. Это пятно и выполняет «изучение» объекта. Соприкасаясь с поверхностью, электронный пучок частично проникает в нее, вытесняя не только электроны, но и фотоны. Они попадают на лучевую трубку, где и из них и формируется изображение.

В сравнении со световыми (оптическими) микроскопами, электронные обладают преимуществами:

Можно получать очень большое увеличение (вплоть до 300000) с сохранением высокого разрешения, вплоть до атомов. Такой результат достигается при прямом наблюдении объекта. То есть не требуется дополнительных увеличений.
Позволяют изучать химический состав образца по точкам. Используется спектральный анализ рентгеновского излучения, которое возбуждается электромагнитным потоком.
Пользователь получает прямую электронно-оптическую информацию об исследуемом объекте. При необходимости ее можно будет дополнить сопутствующими данными, основываясь на электронной дифракции электронов с веществом. Как пример: при помощи дифракционного контраста изображений определяются кристаллографические показатели.
Обеспечивает возможность дополнительного воздействия на объект в ходе исследования. Его можно нагревать, облучать, деформировать, намагничивать. Наблюдение за процессами будет динамическим. Есть возможность фото- и видеофиксации происходящего. Качество изображения будет достаточно высоким.
Есть возможность наблюдать за рельефом поверхности, анализируя катодолюминесценцию. Такую возможность предоставляет электронная растровая разновидность микроскопии.

Виды электронной микроскопии

Выделяют 2 основных вида электронной микроскопии:

Просвечивающая или трансмиссионная – ПЭМ.
Сканирующая или растровая – СЭМ.

Просвечивающая электронная микроскопия

В микроскопах, работающих по этой технологии на объект, воздействует пучок ускоренных электронов, обладающих энергией от 50 до 200 кэВ. Те электроны, которые образец не пропустит, будут отклоняться на небольшой угол. И они, и те, которые пройдут через исследуемый объект с незначительными энергетическими потерями, попадают на магнитные линзы. В результате на фотопленке или люминесцентном экране формируется изображение внутренней структуры. Хорошие результаты дает при исследовании ультратонких образцов – менее 0,1 мкм в толщину.

При работе с ПЭМ одна из наиболее важных задач – различать природу контрастов:

Абсорбционный. Результат неупругого рассеивания электронов, которые проходят через образец. Более плотные элементы будет выделяться темным на общем белом фоне. Если состав образца однородный, контрастировать будут участки разной толщины. Применяется при исследовании микрочастиц на аморфной пленке.
Дифракционный. Формируется при упругом рассеивании электронов, которые проходят через исследуемый образец на неподвижных и стандартно размещенных атомах кристаллической решетки. Подходит для определения кристаллической структуры и размеров решетки.
Амплитудный. Контраст такого типа образуется в результате выделения одного конкретного рефлекса из общей дифракционной картины. Его изображение передается на оптическую ось. При этом прямой пучок окажется на экране светлым, а тот, который отклонился (дифрагированный) – темным. Неоднородности укажут на дефекты кристаллической решетки. Применяется такой метод исследования для определения несовершенства кристаллической решетки, ее природы и свойств.
Фазовый. Образуется при многопучковой электронной дифракции как результат уменьшения или увеличения амплитуды волн с разным сдвигом по фазе. Позволяет определять ориентацию кристаллических решеток разных фаз образца, дефекты решеток.

Одна из разновидностей ПЭМ – просвечивающая электронная микроскопия высокого разрешения (ВРЭМ). Формируется в случае, когда пучок электронов падает параллельно оси кристаллов в условиях фазового контраста. Позволяет диагностировать даже мельчайшие неоднородности кристаллической решетки.

Сканирующая электронная микроскопия

Сканирующей электронной микроскопией (СЭМ) получают изображения поверхности исследуемого образца с высокой разрешающей способностью. Получают трехмерные картинки, которые будут удобными в процессе изучения структуры. Дополнительно можно использовать методики EDX, WDX, чтобы получить информацию о химическом составе околоповерхностных слоев.

В оборудовании сфокусированный электронный пучок средней энергии сканирует образец. Предусмотрено несколько режимов работы:

Режим отраженных электронов.
Режим вторичных электронов.
Режим катодолюминиценции и пр.

Эти методики позволяют не только изучать свойства поверхности, но и получать наглядную информацию о структурах, расположенных на несколько микрон ниже верхнего слоя.

СЭМ может работать только с образами, которые можно погружать в вакуум – твердыми. Жидкие среды предварительно подвергают криозаморозке. Форма и размеры образца ограничиваются только размерами рабочей камеры микроскопа. Эффективность исследования можно повысить путем напыления слоя токопроводящего материала.

Возможности

Технология электронной микроскопии постоянно развивается:

совершенствуются способы подготовки образцов;
разрабатываются методики для получения более качественной и широкой информации;
улучшается электронная оптика;
повышается чувствительность методов анализа применением спектрометрических систем;
разрабатываются методики компьютерной обработки изображений с целью получения более широкой информации о структуре;
тестируются методы компьютеризации, автоматизации путем подключения к микроскопу дополнительной аппаратуры и пр.

Благодаря последним наработкам метод электронной микроскопии используют уже и при работах с влажными образцами, исключая нарушение их структуры и локального состава. Для этого применяется низкотемпературное замещение воды, сверхбыстрое замораживание в среде хладагента, прижим к металлу, который охлаждается жидким азотом и пр. Существенно возможности метода расширило использование компьютерной техники, в частности математическая обработка электронных изображений. Теперь изображения можно запоминать, корректировать контрастность, добавлять оттенки цветов, выделять микроструктуры, убирать шумы, выделять границы исследуемых участков и пр.

Области применения

Метод электронной микроскопии используют для изучения поверхности объектов, ультратонких срезов тканей, микробов. С его помощью определяют строение жгутиков, вирусов и пр. Оборудование, основанное на этой технологии, широко используется в различных научных и производственных отраслях:

Полупроводники, хранение данных. Выполняется анализ дефектов, трехмерная метрология, определяются неисправности, редактируются рабочие схемы.
Биология и медицина. Электронные микроскопы применяют в криобиологии, электронной и клеточной томографии, вирусологии, стекловании. С их помощью определяют локализацию белков, анализируют частички, выполняют фармацевтический контроль качества, получают трехмерные изображения тканей.
Промышленности. Электронные микроскопы позволяют снимать плоские и трехмерные микрохарактеристики, параметры частиц, проводить динамические эксперименты с материалами, получения изображения высокого разрешения. Они применяются в химической, нефтехимической горнодобывающей отрасли, микротехнологии, судебной медицине и пр.
Научно-исследовательские лаборатории. Электронная микроскопия позволяет делать квалификацию материалов, создавать нанопрототипы, исследовать микроструктуры металлов, подбирать материалы и образцы. Микроскопы также применяются для тестирования и снятия характеристик.

Главная задача – подобрать микроскоп, работающий электронным методом под особенности предстоящих работ. В каталоге компании «Sernia Инжиниринг» можно подобрать подходящее оборудование для любой научно-исследовательской и производственной задачи. Приборы поставляются по Москве, Санкт-Петербургу и в другие регионы РФ. Все они имеют сертификаты соответствия, на них действуют гарантии. Узнать актуальные цены, условия сотрудничества, получить консультации и помощь в выборе можно у менеджеров компании. Свяжитесь с ними по телефону или через онлайн-форму.

А.С.Илюшин, А.П.Орешко. Введение в дифракционный структурный анализ. М.: физический факультет МГУ, 2008

Как работает электронный микроскоп? Разбор

Сегодня мы поговорим об обычных и электронных микроскопах, разберемся в том, как они работают и зачем нужны. Но главное, проведем крутой эксперимент.

Валерий Истишев 25 августа 2021 в 09:12

Давайте начнем с маленькой загадки — как вы думаете, что это такое?

Ну а пока представьте, что вы хотите рассмотреть что-то очень маленькое, то что невозможно увидеть просто “присмотревшись повнимательнее”? Или вы хотите увидеть самые мелкие детали чего-то? Что вы используете?

Первое, что приходит в голову — использовать лупу или сразу взяться за микроскоп!

Но что делать, если вы хотите рассмотреть саму структуру чего-то, например, увидеть транзистор в процессоре?

Что вы сделаете? Просто переключитесь в микроскопе на линзу с большим увеличением? Сработает ли это?

Сегодня мы с вами покроем множество очень интересных тем:

посмотрим на настоящий электронный микроскоп,
поймем — зачем он вообще нужен,
разберемся как увеличить что-то в сотни тысяч раз с помощью электронов и расскажем как человек научился видеть отдельные атомы!

Все как вы любите! Подробно и понятно…

Ну и еще сразу вам тут затравочку — сегодня мы посмотрим на Droider в настоящий электронный микроскоп! И нет — это не кликбейт!

Наверняка кто-то из вас в детстве по примеру Шерлока Холмса с помощью обычной линзы разглядывал все вокруг! Ведь это так круто видеть что-то в увеличении — создается ощущение, что открывается абсолютно новый, неизведанный маленький мир.

Так вот, если говорить простыми словами, то по принципу обычной увеличительной линзы и работает обычный оптический микроскоп!

Конечно, его устройство сильно сложнее — микроскоп это комбинация линз с заранее подобранными оптическими параметрами, которые собраны в правильной комбинации. Однако, сам принцип работы остается тем же.

Свет в видимом диапазоне длин волн либо проходит сквозь объект, либо отражается от поверхности, и, проходя, через систему увеличивающих и фокусирующих линз попадает сначала в окуляр и потом к нам в глаз.

Современные оптические микроскопы — это действительно массивные и сложные устройства, состоящие из десятков различных линз и зеркал, которые собраны в особом порядке, чтобы дать человеку возможность смотреть на объекты разного типа и с разным увеличением!

И линзы бывают разные. От линз с 2-3 кратным увеличением до довольно массивных линз со способностью увеличивать объекты в 100 раз. Только посмотрите на разрез линзы от компании Цайз с 50кратным увеличением! А комбинацией с правильным окуляром можно добиться увеличения даже в две тысячи раз.

Проблема

И тут мы можем задать вопрос — в чем же тогда проблема вообще? Ведь можно просто до безумия искривлять линзы и создавать сложные системы, которые будут увеличивать даже в десятки тысяч раз. Таким образом мы и сможем посмотреть на самые крошечные детали чего угодно! Но все как обычно очень непросто и связано это с физическими ограничениями видимого света!

Ведь видимый свет это волна с определенной длинной. Оптический микроскоп использует его оптический спектр, то есть примерно от 800 до 400 нанометров.

А физика, бессердечная такая сволочь, к сожалению не позволяет нам, различать объекты, которые меньше примерно половины длины волны. То есть с помощью обычного оптического микроскопа, мы не сможем различить ничего что мельче примерно 200 нанометров.

Это ограничение получило название в честь Немецкого ученого Эрнста Аббе, которое так и называется — Дифракционный предел Аббе. И он позволяет получить значение минимального разрешения не только для видимого света, но и для любой другой электромагнитной волны. Вы ведь помните что свет — это тоже электромагнитная волна?

Внимательный наш читатель вспомнит, что эту же формулу мы показывали вам в ролике про экстремальную ультрафиолетовую литографию, когда говорили об ограничении разрешения для глубокого ультрафиолета. Так вот тут тоже самое.

Современные микроскопы со специальными линзами, конечно, умеют смотреть на маленькие объекты и позволяет, например, увидеть живые клетки или даже бактерии, но этого все равно не хватает, например, чтобы увидеть вирусы — тот же самый SARS-COV-2.

Решение проблемы

И как же обойти эту проблему? Да и вообще возможно ли ее обойти? Оказалось? что да. В целом есть два пути.

STED микроскопия

Первый путь, о котором мы вам тут расскажем — это изобретение за которое совсем недавно, в 2014 году, была вручена Нобелевская премия по химии.

Это так называемая STED или микроскопия на основе подавления спонтанного испускания. Именно она позволяет преодолеть дифракционный предел оптического микроскопа.

Правда у технологии есть ограничение — совсем не все материалы можно рассмотреть в такой микроскоп. Но она позволила видеть различные сложные белковые, да и другие органические соединения!

Это связано с тем, что необходимо смотреть на материалы, которые могут переходить в особое состояние под воздействием лазерного излучения. То есть в состояние, когда они сами начинают испускать свет!

Как же это работает?

Тут используется два лазера, один из которых называется возбуждающий лазер, и второй, специально подобранный по параметрам длины волны. Он называется охлаждающим лазером.

Этот охлаждающий лазер компенсирует по периметру возбуждение от первого лазера и в результате сочетания этих волн создается очень маленькая область, которая начинает светиться. Появилась возможность различать объекты величиной уже около 30 нм, что уже позволяет видеть вирусы, например! А это почти в 7 раз меньше, чем у обычного микроскопа! Все равно, что с Земли рассмотреть футбольный мяч на Луне! Вот такой вот элегантный метод обмануть физику!

Электронный микроскоп

Ну хорошо. Теперь мы разобрались с тем, как можно преодолеть физический барьер в оптической микроскопии. Какой же второй путь обхода барьера? Да и что делать, если мы хотим увидеть неорганические вещества или вообще что-то меньше 30 нанометров?

И тут мы опять возвращаемся к нашей формуле, которая говорит нам о том, что максимальное разрешение — это половина длины электромагнитной волны. И ученые подумали — а зачем использовать видимый спектр, когда можно взять что-то с очень короткой длиной волны и пошли смотреть, что же там есть в коротковолновом спектре!

В общем, они решили не мелочиться и использовать сразу пучок электронов. Ведь длина волны электронов, ускоренных в электрическом поле равна примерно 0,4 Ангстрем. Или 0.04 нанометра! Это в 10 тысяч раз меньше, чем у видимого света! Кстати, если вы не знали, то размер атома водорода как раз около 1 Ангстрема. Итак, давайте разберемся что же такого крутого в электронных микроскопах!

Источник электронов и линзы

Сам концепт и первый прототип такого микроскопа был представлен, вы не поверите, еще в 1932 году, в Германии, и выглядел он вот так!

В целом, принцип работы с тех пор остался почти неизменный, хотя конечно его использование стало намного более User Friendly.

Но как же он работает?

Если вы смотрели наше крутое видео о магии создания процессора или читали материал, то там мы рассказывали, что для испарения некоторых материалов используется сфокусированный луч электронов и источником этих электронов служит вольфрамовая нить. В электронном микроскопе все примерно также. Зачастую вольфрам служит источником электронов. Тонкая нить нагревается до высоких температур и начинает испускать электроны в большом количестве.

А дальше начинается самое интересное. Эти электроны надо ускорить и сфокусировать. Да — сфокусировать именно так, как вы фиксируете свет в вашем объективе или обычном оптическом микроскопе. Только в этом случае воспользоваться стеклянными линзами просто не получится — весь электронный пучок полностью поглотится на самой первой линзе. В итоге для этого надо использовать электростатические линзы. Фактически, это такие электроды специальной формы, которые создает определенное электромагнитное поле. Это и позволяет фокусировать луч электронов, а также ускорять их до больших энергий!

Так же как и свет, падающий на поверхность материала в оптическом микрокопе, электронный луч дает нам информацию и позволяет фактически увидеть образец.

СЭМ

Тут стоит сказать, что в целом существует два основных типа электронных микроскопов, которые очень сильно отличаются.

Первый — это так называемый сканирующий электронный микроскоп, или просто СЭМ.

В нем сфокусированный пучок электронов попадает на поверхность образца практически любого размера, и происходит магия физики, из-за которой одни электроны выбивают другие электроны из атомов материала, на который мы смотрим.

Эти новые электроны называются вторичными и обладают относительно маленькими энергиями, что и позволяет специальному детектору их легко улавливать. Появление этих вторичных электронов происходит очень локально и это позволяет повысить точность получение изображения.

Дальше сфокусированный пучок начинает сканировать поверхность материала и в зависимости от рельефа поверхности на детектор попадает разное количество вторичных электронов. Вот так и получается картинка.

Именно поэтому все изображения с электронного микроскопа черно-белые. То есть фактически — это просто разная интенсивность в разных участках снимка. А любые цветные изображения с электронного микроскопа — это просто раскрашенные картинки.

СЭМы — самые часто используемые микроскопы на производствах процессоров, так как они позволяют быстро посмотреть на качество поверхности, да и вообще их используют для контроля на каждом этапе изготовления.

ПЭМ

И перед тем, как мы посмотрим на Droider в микроскоп, надо рассказать про еще один незаменимый инструмент в руках ученых и инженеров!

Это просвечивающий электронный микроскоп или ПЭМ! Это огромная труба, занимающая одну, а то и две комнаты. А стоит он около миллиона долларов. Но на самом деле интересно не то сколько он стоит, тут понятно что такая техника очень дорогая.

Интересно то, что для его работы строят специальные комнаты, с огромными бетонными подушками, уходящими на много метров под землю. Они нужны чтобы гасить любые вибрации и возмущения — вот настолько чувствительно это оборудование. Если бы не такие подушки, то любое изображение было бы смазанным из-за того, что кто-то хлопнул дверью в другом конце здания.

Его отличие от СЭМа в том, что он имеет гораздо большее разрешение! И связано это с особенностями самого образца и пучка электронов.

Если в СЭМе мы регистрировали новые электроны, которые вылетели из нашего образца под воздействием электронного пучка, то в ПЭМе мы смотрим на то как меняется наш исходный пучок электронов, который пролетел сквозь образец.

Суть в том, что пролетая через образец и взаимодействуя с атомами материала электроны меняются, а дальше попадают в детектор, который уже и говорит нам о том, как именно поменялся сам исходный пучок электронов.

Если вы внимательно слушали наше объяснение, то вы можете спросить, как же так — ведь электроны просто рассеются в образце и мы ничего не увидим.

И вы будете абсолютно правы! Ведь для ПЭМа нужно специально подготавливать образцы — они должны быть очень тонкими. До 100 нанометров, а вообще чем тоньше, тем лучше. В идеале всего десять-двадцать нанометров.

Для этого используются сложные методы подготовки образцов, например специальный луч ионов, который как тонкий лазер вырезает маленький кусок образца, который потом исследуют уже в микроскопе. Это и позволяет с помощью ПЭМа ученым видеть даже отдельные атомы!

Вот посмотрите: каждая точка это атом Палладия, видно даже то насколько ровная кристаллическая решетка у материала! Обратите внимание на шкалу в левом нижнем углу, всего один нанометр. И мы уже сейчас можем такое видеть, потрясающе!

Droider в электронном микроскопе

Теперь когда мы с вами разобрались с тем, как работает электронный микроскоп — настало время посмотреть на надпись Droider в настоящий электронный микроскоп, а точнее в СЭМ. Она была вырезана лазером на тонком листе нержавеющей стали. Более того были сделаны много надписей от большой, до надписи размером несколько микрометров.

Тут вы видите загрузку этой пластины в микроскоп!

А вот сама пластина в микроскопе уже. Кстати на всех этих картинках обращайте внимание на шкалу масштаба и на цифры в у параметра Mag, то есть увеличение! Вот уже можно рассмотреть надпись Droider с увеличением в 55 раз.

Так едем вниз к надписи поменьше.

Интересно, а какой толщины буква i в этой надписи — давайте глянем. Всего 100 микрометров, чуть толще человеческого волоса.

Так? но есть надпись и еще меньше — едем еще ниже и смотрим внимательнее.

Тут уже видно что увеличение 200 раз, но сама надпись уже плохо различима. Но это проблема не микроскопа, а лазера которым вырезалась надпись. Он просто не может такую мелкую надпись сделать! Ведь тут буква i уже 40 микрометров.

Но раз мы уткнулись в ограничения лазера, то давайте вернемся обратно, к самой большой надписи и посмотрим на структуру самой стали. Итак вот самая большая i. Пол миллиметра в толщине. Приближаем к нижнему краю.

Так увеличение уже почти полторы тысячи раз. Самое время посмотреть на то какой толщины след от лазера. Всего 40 микрометров.

Едем еще ближе и вот увеличение уже 6300 раз. Вот и ответ на наш вопрос из начала видео — это структура обработанной и необработанной стали!

Давайте посмотрим еще ближе теперь увеличение уже 40 тысяч раз. Мы уже в наномире! Смотрите какая красота — это сталь, по которой прошелся лазерный луч, когда вырезал букву i в слове Droider!

Но еще интересно глянуть, как выглядела сталь до обработки — что ж давайте глянем с таким же увеличением. Разница огромная!

Ну и наконец, давайте глянем на обработанную сталь с огромным увеличением в 300 тысяч раз. Ширина этого канала от лазера всего 300 нанометров!

Выводы

Электронный микроскоп — незаменимый инструмент в руках ученых и инженеров. Он не просто позволяет посмотреть на что-то маленькое — он позволяет увидеть саму структуру материалов, вплоть до атомов! Кроме того эти микроскопы позволяют смотреть не только на структуру, но и определять химический состав материала!

Это все очень полезно, когда например инженеры на производстве микропроцессоров или экранов пытаются понять, где и какой материал они осадили, как выглядят их транзисторы, много ли дефектов, да и вообще выявить брак.

Конечно, мы тут почти не сказали о том, как подготавливаются образцы для изучения, и например о том, что все такие микроскопы работают в глубоком вакууме, для получения которого используют специальные насосы, которые вращаются со скоростью в 50 тысяч оборотов в минуту. В общем, нам есть, что обсудить и рассказать…

Увидеть незримое и почувствовать неосязаемое. На что еще способен электронный микроскоп?

Ни для кого не секрет, что существуют вещи и организмы настолько маленькие, что увидеть их невооруженным глазом просто невозможно. Однако за последние сто лет наука шагнула далеко вперед. И теперь мы можем не только посмотреть на инфузорию, но и увидеть собственными глазами атомы, и даже, буквально, пощупать рельеф микроструктуры кристаллов. А все благодаря электронной микроскопии… Давайте разберемся, как такое возможно.

Перед вами небольшой обзор на электронные микроскопы и их возможности.

Изображение вируса Эбола, полученное при помощи просвечивающей электронной микроскопии

Несмотря на то, что «электронная микроскопия» звучит очень современно, запатентована она была еще в 1931 году германо-американским инженером и изобретателем Райнхольдом Руденбергом. Это был настоящий переворот в области изучения микроструктур.

В световом микроскопе, которым на тот момент пользовались исследователи, изображение давали световой луч и незамысловатая конструкция из оптических линз. В электронном микроскопе (ЭМ) роль луча выполнял поток электронов в вакууме, фокусируемый, словно линзами, электромагнитными катушками.
Изображение передавалось на флюоресцирующий экран, где его можно было детально рассмотреть. Данная технология позволила исследовать микроструктуры твердых тел, их локальный состав, а также электромагнитные поля.

▎В чем суть электронной микроскопии?

Как уже было сказано, на исследуемый объект подается пучок электронов, который фокусируется на образце при помощи электромагнитного поля. «Точка» фокусировки электронов имеет не более 5 нм в диаметре. Для сравнения, толщина волоса — 80 000 нм. При соприкосновении с объектом электроны частично проникают внутрь, вытесняя родные электроны и фотоны образца, которые, в свою очередь, попадают на лучевую трубку, где и формируется изображение.

▎Каковы преимущества электронной микроскопии?

Первое и основное отличие от светового микроскопа — увеличение. Профессиональный современный световой микроскоп может увеличить изображение в 2 тысячи раз. Электронный микроскоп дает увеличение до 300 тысяч при разрешающей способности 0,5 нм. На таком увеличении уже можно рассмотреть атомы.
Второе существенное преимущество — при помощи спектрального анализа рентгеновского излучения, возбуждаемого электромагнитным полем, можно изучить химический состав образца в конкретных точках.
В процессе можно воздействовать на исследуемый объект: облучать, нагревать, намагничивать или деформировать. И полученная картинка будет динамически изменяться.
Имеется возможность зафиксировать процессы на фото- или видеосъемку в высоком разрешении.
Исследователь получает электронно-оптическую информацию, которую можно дополнить данными, основанными на дифракции электронов с материалом исследуемого объекта. К примеру, определение показателей кристаллографии при использовании дифракционного контраста.
В растровой разновидности электронной микроскопии можно рассматривать рельеф поверхности объекта при помощи анализа катодолюминесценции.

▎А каковы недостатки?

⁣ ⁣ ⁣ ⁣ ⁣ ⁣А вот недостатков много:

Во-первых, в отличие от светового микроскопа, в котором образец можно просто поместить под окуляр, в ЭМ для работы необходим вакуум. Поэтому исследуемые образцы должны быть хорошо обработаны и зафиксированы. А потому невозможно исследовать живые объекты.
Во-вторых, необходимо сделать ультратонкий срез исследуемого образца: от 20 до 50 нм, который к тому же должен быть равномерным. Иначе электронный поток поглотится объектом и картинки не будет.
В-третьих, требуется высокое напряжение — от 50 кВ. А вместе с ним и специальная система охлаждения.
Из-за повышенной чувствительности и хрупкости ЭМ нужно размещать абсолютно неподвижно, на виброустойчивой колонне, в здании без внешних магнитных полей.
ЭМ создает исключительно черно-белые изображения.
И, конечно, стоимость. Далеко не каждый исследовательский центр может позволить себе ЭМ. Он дорог и при покупке, и в обслуживании.

Трансмиссионная или просвечивающая электронная микроскопия (ПЭМ)
Растровая или сканирующая электронная микроскопия (СЭМ)

Нитчатая водоросоль в световом микроскопе (а), СЭМ (б) и ПЭМ (в)

▎Просвечивающий электронный микроскоп

ПЭМ похож на обычный световой микроскоп, но вместо луча света используется поток электронов, а длина волны намного меньше, чем фотонная. Поэтому изображения получаются в более высоком разрешении.

Вирус свиного гриппа в просвечивающим электронном микроскопе

Фокусировка электронного потока осуществляется при помощи электромагнитных и электростатических линз. Возникают даже присущие фотонным микроскопам хроматические аберрации. Только природа такого искажения абсолютно иная. Кроме того, за счет закручивания электронов вдоль оси пучка в линзе, возникают дополнительные искажения.

У ПЭМ очень высокое разрешение, что позволяет разглядеть атомы вещества и детально рассмотреть, к примеру, возбудителя вирусного заболевания. Собственно, с появлением полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА), электронным микроскопом перестали активно пользоваться для определения вирусов. И дело опять в стоимости и трудоемкости..

Из недостатков: объект, помещаемый в ПЭМ, должен быть не толще 1 микрона, то есть как один слой волоса, разрезанного вдоль на 50 частей. А вторая проблема — размер. ПЭМ занимает целую комнату: высотой в человеческий рост и с блоком питания, размером со шкаф.

ㅤㅤㅤ Просвечивающий электронный микроскоп

▎Сканирующий электронный микроскоп

СЭМ позволяет получать изображение очень высокого разрешения. Узко сфокусированный луч электронов микрон за микроном сканирует поверхность изучаемого образца. СЭМ дает возможность, в том числе, получить трехмерное изображение. У данного типа микроскопов имеется большое количество датчиков, способных улавливать все вытесняемые электронами частицы: электроны, видимый инфракрасный и ультрафиолетовый спектры света, рентгеновское излучение.

В отличие от ПЭМ, работа которого похожа на работу оптического микроскопа, работа СЭМ напоминает устройство старого телевизора. В таких телевизорах есть электронно-лучевая трубка. По ней в вакууме проходят электроны, испускаемые электронной пушкой, и есть система корректирующих движение линз, которые могут фокусировать или отклонять электроны. В СЭМ все то же самое, только электронами обстреливают исследуемый объект, а не люминофоры экрана, а вся поступающая информация фиксируется различными детекторами..

ㅤㅤ Сканирующий электронный микроскоп

У СЭМ есть несколько принципиально разных режимов работы, которые зависят от детекторов.

Рассмотрим основные виды:

• Детектор вторичных электронов

Используется для определения морфологии поверхности образца, поскольку сигнал вторичных электронов высокочувствителен к рельефу, шероховатостям и неровностям. Чаще всего данный режим работы используется в биологии для определения пор, борозд и изломов, к примеру, при изучении бактериальной клетки.

Изображение пыльцы, полученное путем детектирования вторичных электронов

• Детектор обратно отраженных или обратно рассеянных электронов

Используется для определения состава разносоставного вещества со множеством включений, поскольку сигнал рассеянных электронов чувствителен к специальному композиционному контрасту. Таким образом, на получаемом изображении, вещества разного состава в одном объекте будут иметь разные оттенки серого. Данный режим применяется, в основном, в кристаллографии и биологии.

Морфология интерфейса между оксидной и металлической составляющими, сделанная в режиме детектирования отраженных электронов

• Энергодисперсионный спектрометр

Позволяет определить элементный состав веществ и включений исследуемого образца. Конечно, в большинстве случаев важнее определить химический, а не элементарный состав. Зато энергодисперсионный спектрометр позволяет точечно, для каждого микрокомпонента определить состав. Кроме того, для данного метода не требуется никаких реагентов. Используется в химии и кристаллографии.

Анализ элементного состава микрокомпонентов полированного образца анодного шлака с помощью энергодиспрсионного спектрометра

• Детектор прошедших электронов

Электроны, прошедшие тонкий срез образца насквозь, приходят к датчику под разным углом, что дает различную информацию об исследуемом объекте. Угол рассеивания зависит от толщины среза, материала образца и энергии первичного электронного пучка. Детектор передает псевдоцветное изображение, где каждый цвет соответствует своему сигналу.

Коррозия, распространяющаяся сквозь хромовое покрытие на стали. Изображение получено при помощи детектирования прошедших электронов.

• Детектор катодолюминесцентного излучения

Используется при изучении материалов, обладающих люминесценцией, то есть способные излучать видимый свет при попадании на них электронного потока.

Катодолюминесценция — это, по сути, способность вещества замещать оставленные после облучения электронами дырки, захватывая свободные электроны и выделяя световую энергию. Это свойственно для металлов: чистых и с примесями. Свет, производимый металлом с примесью, будет другого оттенка, что и будет фиксироваться детектором..

Изображение циркона, полученное
при детектировании катодолюминесцентного излучения

СЭМ может работать исключительно с твердыми образцами в вакууме. Поэтому для работы с жидкостями, их необходимо подвергнуть глубокой заморозке. Зато форма и размер образца могут быть любыми в пределах объема рабочей камеры. Продуктивность работы повышается при нанесении на исследуемый образец тонкого слоя токопроводящего материала.

Электронная микроскопия применяется во многих сферах науки и промышленности:

Биология и медицина

При помощи ЭМ можно осуществить томографию тканей, детально рассмотреть клетки, определить локализацию белков, увидеть вирус и даже выполнить фармацевтический контроль качества.

Физика, химия и кристаллография.

ЭМ позволяет изучить микроструктуры металлов и кристаллов вещества, классифицировать материалы, тестировать характеристики различных веществ, определять состав, поверхность и плотность объектов.

Полупроводники и хранение данных
С помощью ЭМ выявляются и редактируются неисправности систем, выполняется анализ дефектов.
Промышленность

ЭМ помогает определять параметры частиц и целых структур. Позволяет в динамике посмотреть на материалы в высоком разрешении. При необходимости дает возможность построения трехмерной модели микроструктуры.

В некоторых сферах электронная микроскопия незаменима. Поэтому исследователи постоянно работают над усовершенствованием методов и возможностей в данной области. Рассмотрим некоторые из них.

▎3D моделирование

В некоторых случаях, к примеру, в биологии и медицине, могут потребоваться не просто фотографии ультратонких срезов, а трехмерные изображения какой-либо ткани или организма.

Это возможно осуществить несколькими способами:

1. ПЭМ серийных срезов

Самый первый из подходов к трехмерному моделированию на электронном микроскопе. Способ заключается в создании ленты ультратонких срезов, которые собираются на специальной сетке, покрываемой углеродом и особым веществом — формваром. Полученные изображения обрабатываются в специальной программе: создается контур, фотографии выравниваются, обрезаются и сводятся в одно трехмерное изображение. Процесс сведения трудоемкий и занимает очень много времени, а размеры изображения ограничены. Еще одной проблемой являются существенные зазоры между слоями. Кроме того, ультратонкие срезы очень хрупкие и подвержены повреждениям. И чем их больше, тем выше шанс деформации образца.

2. Криоэлектронная томография

По сравнению с ПЭМ серийных срезов, позволяет увидеть в более высоком разрешении более мелкие структуры, величиной от 3 нм, к примеру, элементы цитоскелета. Однако образцы должны быть довольно мелкими (100—500 нм) поэтому КЭТ не применима для крупных объектов и подходит только для молекулярных комплексов, вирусов и мелких бактерий.

Принцип метода криоэлектронной томографии

В процессе КЭТ объект исследования постепенно поворачивается и изображения получаются под разным углом наклона. После этого все фотографии сводятся в одно 3D изображение. Минус метода в том, что образец получает высокую дозу излучения, за счет чего часть мелких деталей теряется в процессе исследования.

3. Многоэнергетическая деконволюция

При помощи этого метода можно получить несколько изображений образца на разной его глубине, не разрушая поверхности объекта. Такой эффект достигается за счет изменения ускоряющего напряжения электронов. И чем выше энергия, тем глубже в объект может проникнуть электрон. Каждое изображение будет давать характеристику определенного слоя. А специальный программный алгоритм соберет множество срезов в трехмерную модель с максимальным разрешением до 10 нм. Помимо прочего, данный метод можно использовать совместно с методом ультратонких срезов.

4. Фокусирующая ионно-лучевая сканирующая электронная микроскопия (ФИЛ-СЭМ)

Суть метода заключается в параллельном «разрезании» исследуемого образца на слои пучком ионов галлия и сканировании объекта электронным пучком. Слой получается толщиной 5—10 нм. Полученные изображения собираются в единую трехмерную модель.

Раскрашенное изображение бактериофагов
(зеленые), поразивших кишечную палочку (голубые), сделанное в ФИЛ-СЭМ

Сложность метода в подготовке. Перед проведением операции необходимо защитить образец от части заряда. Для этого на сам объект, к примеру, кусок органа, напыляется металл, а блок, в который заключен образец, покрывается серебряной пастой. Максимальный размер моделируемого объекта — 100*100 мкм. Кроме того, метод очень долгий, а с увеличением глубины резки снижается качество.

Принцип метода ФИЛ-СЭМ

5. СЭМ с автоматизированной лентой для сбора срезов

По сути, это улучшенная версия метода серийных срезов. Специальная насадка на ультрамикротом, который делает срезы, работает автоматически и способна делать до 1000 срезов в день, помещая их на специальную ленту. Далее лента разрезается на фрагменты, кладется на подложку, срезы обрабатываются контрастом и углеродом, после чего разрезанный образец помещается в СЭМ. Полученные изображения имеют разрешение 5 нм.

Ультрамикротом со специальной насадкой и вставленной лентой для срезов

6. Последовательная сканирующая электронная микроскопия поверхности блока

Используется для получения трехмерной модели большого объекта. Для этого ультрамикротом помещается внутрь СЭМ. В процессе происходит последовательное срезание ультратонких слоев образца с последующим сканированием. Для улучшения изображения может использоваться контраст. Преимущество данного метода заключается в величине объекта и скорости обработки информации. За получаемыми данными можно наблюдать в реальном времени.

▎Цветное изображение

Большим минусом ЭМ является черно-белое изображение. Однако и с этим ученые смогли справиться.

Самый простой метод — коррелятивная свето-электронная микроскопия (КСЭМ). Для окрашивания изображения один и тот же объект фотографируется в световом и в электронном микроскопе, а затем программа соединяет два изображения. Однако из-за разницы в разрешении изображение лишь радужно подкрашивается согласно распределению флуоресцентного красителя. Выделить микроструктуры таким образом не удастся.

Коррелятивная свето-электронная микроскопия элементов цитоскелета

Ученые объединили КСЭМ с трехмерной световой микроскопией, уже известной нам ФИЛ-СЭМ и с микроскопией сверхвысокого разрешения (СР-микроскопия), которая позволяет получить большее разрешение за счет объединения на экране множества снимков.

Срез ядер нейронов при микроскопии сверхвысокого разрешения

Составив изначально изображение высокого разрешения, ученые резали образец лучами ионов. Изображение получало цвет за счет световой микроскопии структурированного освещения, позволяющего увеличить разрешение снимка в два раза за счет поочередной подсветки отдельных точек при фоновом свечении остального образца, и одномолекулярной световой микроскопии, при которой флуоресценция красителя активируется слабым лазером. Одномолекулярная микроскопия позволяет получить изображение с разрешением 0,2 мкм. Все полученные изображения свели вместе и получили полноценные цветные снимки. С помощью данной методики удалось разглядеть, к примеру, ультраструктуру нейронов.

Трехмерные модели ядер нейронов, полученные при коррелятивной микроскопии

Итак, электронный микроскоп — вещь, во многих сферах незаменимая. Ученые потихоньку нивелируют его минусы и решают проблемы, связанные с его использованием. Возможно, в скором времени, из минусов останутся только размер и стоимость. Хотя… Может, и это исправимо?

Автор: Соловьёва Софья, микробиолог.

Использованная литература:

Гоулдстейн Дж., Ньюбери Д., Эчлин П., Джой Д., Фиори Ч., Лифшин Ф. Растровая электронная микроскопия и рентгеновский микроанализ: в двух книгах. Пер. с англ. — М.: Мир, 1984. 303 с.

Уманский Я. С., Скаков Ю. А., Иванов А. Н., Расторгуев Л. Н… Кристаллография, рентгенография и электронная микроскопия. — М.: Металлургия, 1982, 632 с.

СиндоД. Оикава. Т. Аналитическая просвечивающая электронная микроскопия. — М.: Техносфера, 2006, 256 с. ISBN 5-94836-064-4.

Denk, W., & Horstmann, H. (2004). Serial block-face scanning electron microscopy to reconstruct three-dimensional tissue nanostructure. PLoS Biology, 2(11).

Efimov, A. E., Tonevitsky, A. G., Dittrich, M., & Matsko, N. B. (2007). Atomic force microscope (AFM) combined with the ultramicrotome: A novel device for the serial section tomography and AFM/TEM complementary structural analysis of biological and polymer samples. Journal of Microscopy, 226(3), 207–217. doi.org/10.1111/j.1365-2818.2007.01773.x

Peddie, C. J., & Collinson, L. M. (2014). Exploring the third dimension: Volume electron microscopy comes of age. Micron. Elsevier Ltd. doi.org/10.1016/j.micron.2014.01.009

Schalek, R., Kasthuri, N., Hayworth, K., Berger, D., Tapia, J., Morgan, J., … Lichtman, J. (2011). Development of High-Throughput, High-Resolution 3D Reconstruction of Large-Volume Biological Tissue Using Automated Tape Collection Ultramicrotomy and Scanning Electron Microscopy. Microscopy and Microanalysis, 17(S2), 966–967. doi.org/10.1017/S1431927611005708

Wagner, J., Schaffer, M., & Fernández-Busnadiego, R. (2017, September 1). Cryo-electron tomography—the cell biology that came in from the cold. FEBS Letters. Wiley Blackwell. doi.org/10.1002/1873-3468.12757